1、 本科毕业论文1,3-二氯丙烯熏蒸剂对土壤细菌微生物多样性的影响1-3 two allyl chloride fumigant effect on soil bacteria microbial diversity系（院）名称： 太原师范学院学院 专 业 班 级： 10 级生物科学 学 生 姓 名： 韩超 学 号： 2010131126 指导教师姓名： 燕平梅 指导教师职称： 教授 2014年 5月目录中文摘要 .1英文摘要 .2引言 .3第一章 材料和方法 .41.1 实验材料 .41.2研究方法 .51.2.3 变性梯度凝胶电泳（DGGE） .5DGGE凝胶系统是由变性胶和上层胶组成的，具
2、体配方见表 2.1.51.2.3.1 16S rDNA V3片段的 PCR扩增 .61.2.3.2 切胶回收 .61.2.3.3 16S rDNA V3片段的二次 PCR及产物回收 .61.2.3.4 细菌 16S rDNA V3片段的克隆测序 .61.2.4 DGGE图谱分析方法 .71.2.7 系统发育分析方法 .7第二章 结果与分析 .82.1土壤微生物总 DNA 的提取 .82.2 土壤样品基因组 DNA 的 PCR 扩增 .82.3微生物的 DGGE 凝胶图谱的分析及比较 .82.5 相似性聚类分析 .10图 2.5 相似性聚类分析图 .11第三章 讨论与结论 .11致 谢 .121
3、1-3 二氯丙烯熏蒸剂对土壤细菌微生物多样性的影响姓名：韩超 指导教师：燕平梅 摘要：为了研究 1,3- 二氯丙烯土壤熏蒸剂处理对土壤微生物细菌的多样性的影响。别在温室大棚以1-3 二氯丙烯混合式（27g/m 2） 、1-3 二氯丙烯顺式（27g/m 2） 、1-3 二氯丙烯反式（27g/m 2） 、溴甲烷（50g/m 2） 、对照的浓度采用覆膜熏蒸法熏蒸。收集土壤并提取土壤微生物的 DNA。PCR 扩增后，采用 DGGE 图谱分析方法测定土壤微生物细菌多样性。结果表明：4 种熏蒸剂对土壤进行处理后，总体上看土壤当中的多样性、均匀度、丰富度都有减小的趋势，但是在每一项当中又有例外，多样性中，3
4、号样品即用 1-3 二氯丙烯反式（27g/m 2）处理是个例外，多样性没有减小反而略有增加。均匀度中，4 号即用溴甲烷（50g/m 2）处理是一个例外，没有减小均匀度反而增大， 丰富度中，3 号样品即用 1-3 二氯丙烯反式（27g/m2）处理过的土壤样品微生物细菌丰富度增大没有减小。在相似性聚类分析中可以看出，5 个样品中，细菌微生物群落多样性的相似性程度并不高，其中 3 号样品和 5 号样品的相似度最高但也只有 62%左右。结论是什么、？关键词：1,3- 二氯丙烯；土壤微生物；多样性；1-3 two allyl chloride fumigant effect on soil bacter
5、ia microbial diversityAbstract: in order to study the 1, 3 - dichloro propylene soil fumigants treatment on the influence of the diversity of soil microbial bacteria. Dont in greenhouses with 1-3 two allyl chloride hybrid (27 g/m2), 1-3 allyl chloride cis (27 g/m2), 1-3 allyl chloride trans (27 g/m2
6、), methyl bromide (50 g/m2), the concentration of the contrast effect of fumigation method is used to fumigation. Collect soil and extract the soil microbial DNA. After the PCR amplification, using DGGE spectrum analysis method for determining soil microbial diversity. The results showed that the fo
7、ur kinds of soil fumigants on after processing, the overall diversity, evenness and richness of the soil has a decreasing trend, but in the middle of each and there are exceptions, diversity, 3 samples with 1-3 two allyl chloride trans (27 g/m2) processing is an exception, diversity, instead of bein
8、g decreased slightly increased. Evenness, with 4 methyl bromide (50 g/m2) processing is an exception, did not decrease instead of increase, richness, 3 samples with 1-3 two allyl chloride trans (27 g/m2) treated soil samples of microbial bacteria abundance increase didnt decrease. In similarity can
9、be seen in the clustering analysis, five samples, bacteria microbial community diversity of similarity degree is not high, among them 3 samples and 5 samples of the highest similarity but also only about 62%.Key words: 1, 3 - dichloro propylene; Soil microbes; Diversity;2引言1,3-D 作为土壤熏蒸杀线虫剂，主要用于蔬菜、苗木
10、、观赏性园艺作物、果树、草莓和葡萄等高投入、高产值作物种植前土壤消毒处理，对于多种土传病虫害具有很好的防治效果，但对于一些土传病原菌的厚垣孢子、菌核以及杂草的休眠种子活性较差（Duniway，2002；Zasada 等，2010） 15。 参考文献上标是从 1开始的，不是从 15。请下边的参考文献上标号按顺序排列、！国内外研究者对 1,3-D 的应用展开了多方面的研究。国内方面，范昆等采用盆栽和田间试验研究了 1,3-D 对番茄根结线虫病的防治效果（范昆等，2006b） 。结果表明各剂量 1,3-D 熏蒸处理土壤均能显著减轻番茄根结线虫病的为害，刺激番茄生长。宋兆欣等采用室内生物测定及田间试验
11、测定 1,3-D 对土传病原菌和根结线虫的生物活性及田间应用效果，探索 1,3-D 为甲基溴替代品的可行性（宋兆欣，2008） 。结果表明，1,3-D 能够有效防治根结线虫和土传病原菌，而且对黄瓜、番茄有明显的增产效果。颜冬冬等通过室内培养的方法，以北京黄瓜和番茄大棚轮作地土壤为对象，研究 1,3-D 对土壤氮素转化的影响（颜冬冬等，2010） 7。结果表明，1,3-D 处理后能显著增加土壤中 NH4+-N 累积量，而在后期培养过程中，各处理矿化作用和硝化作用都逐渐恢复至对照水平。 国外方面，Klose 等人研究了杂草种子和土传病原物对 1,3-D+氯化苦（InLine）的剂量响应关系（Klo
12、se 等，2007） 。结果表明，在杂草中，马齿苋的种子是对 InLine 最为敏感，其次是繁缕和蓼属植物，小花锦葵和牻牛儿苗的种子对 InLine 不敏感；在所有的病原菌中，腐霉最敏感而黄萎病菌最不敏感，辣椒疫霉和枯萎病菌表现出中等程度的敏感性。Santos 等人进行大田试验明确了 1,3-D+氯化苦在鲜食番茄上与甲基溴相比在控制线虫、土传病害和杂草的效果（Santos 等，2006） 8。结果表明，1,3-D+氯化苦与敌草胺+氯吡嘧磺隆或是甲氧毒草胺或是三氟啶磺隆混用，其效率与甲基溴+氯化苦相当，并且在两个生长季节 1,3-D+氯化苦在 VIF 下始终与甲基溴+氯化苦效果相当。Gilrea
13、th 等进行田间试验来对照不同的除草剂与 1,3-D+氯化苦（C-17）混用对莎草的控制作用和它们对番茄和辣椒的产量效果（Gilreath 等，2004） 。结果表明，虽然 C-17 能减少了莎草的密度，但是只依靠熏蒸剂不足以避免番茄产量损失。因此，有必要将熏蒸剂与除草剂混用来增强对莎草的控制效果。Klose 等研究了甲基溴替代物 1,3-D、溴丙炔、甲基碘和氯化苦熏蒸土壤后对于土壤酶的影响（Klose 等，2004） 。结果表明，土壤施用甲基溴替代物后具有改变土壤微生物群落的潜力，并在营养转化过程中发挥重要作用。Dungan 等人研究了经 1,3-D 和溴丙炔熏蒸处理过的土壤的微生物群落变化
14、情况（Dungan 等，2003） 。结果表明可以通过向土壤中添加有机质来减少熏蒸剂对于土壤微生物群落的影响 9-14。 31 材料和方法1.1 实验材料供试土壤供试土壤为北京市密云县黄瓜大棚轮作3年以上土壤。土壤为沙壤土，其理化性质为：有机质3255 gkg，铵态氮6991 mgkg，硝态氮24876 mgkg，速效钾43931 mg/kg，有效磷66077 mg/kg，pH 685。表 1.1 土壤理化性质分析有机质 铵态氮 硝态氮 速效钾 有效磷 pH255 gkg 6991 mgkg 24876 mgkg 43931 mg/kg 66077 mg/kg 6851.1.1 药品1, 3-
15、二氯丙烯(1, 32Dichloropropene)97%原油(山东淄博鲁达化工有限公司)。1.2 研究方法1.2.1 土壤的处理试验地前茬为番茄，于 2010年 11月 2日分别在温室大棚以 1-3二氯丙烯混合式（27g/m 2） 、1-3二氯丙烯顺式（27g/m 2） 、1-3 二氯丙烯反式（27g/m 2） 、溴甲烷（50g/m 2） 、溴甲烷（30 g/m2） 、对照的浓度采用覆膜熏蒸法熏蒸，半个月揭取 PE膜，定值黄瓜苗。在黄瓜生长期未施用化学肥料。土壤样品采样时间为 2011年 10月 22日，采用对角线取样法取三个大棚 515cm土壤样品，混合后保存于-20和-80各一份备用。1
16、.2.2 土壤总 DNA 的提取与检测土壤总 DNA的提取按照 MO BIO 公司生产的土壤 DNA提取试剂盒步骤提取。DNA 提取物用 2%胶浓度的琼脂糖凝胶电泳检测。每个处理样品 3个重复，然后混合 DNA提取液，保存于-20冰箱中备用。1.2.3 变性梯度凝胶电泳（DGGE）DGGE凝胶系统是由变性胶和上层胶组成的，具体配方见表 2.1表 1.2 变性梯度凝胶的配方Table 2.1 Denatured gradient gel formula变性胶浓度 上层胶浓度试剂35% 50% 8%40%Acryl/Bis Solution20ml 20ml 1ml50xTAE buffer 2m
17、l 2ml 100lFormamide Deionized 14ml 20ml -Urea 14.7g 21g -ddH2O补至 100ml 100ml 5ml10%Ammonium persulfate20l 20l 10lTEMED 160l 160l 80l4操作步骤:1.将海绵胶条固定在制胶架上,把类似“三明治”结构的制胶板系统垂直放在海绵胶条上方用分布在制胶架两侧的偏心轮固定好制胶板系统。2 在两个注射器上分别标记“高”与“低” 。3.逆时针方向旋转凸轮到传送体积的起始位置，固定体积调整旋钮。调整梯度传送系统的刻度到12.5ml。4.取表 2.1配制好的变性胶各 12.5ml，分别加
18、入 10%的 Ammonium persulfate 20l 和 TEMED160l,混匀后迅速用标记高的注射器将 50%的变性胶吸入注射器以及标记低的注射器将 35%的变性胶吸入注射器，推动注射器排除体系空气,并安装上相关的配件。5匀速旋转凸轮进行灌胶，完成后注入 1ml无菌水，静置凝固约 45min，小心倾倒出上层无菌水，用滤纸小心拭去制胶板上水珠，迅速注入上层胶 5ml（加入 10%的 Ammonium persulfate 10l 和 TEMED 80l） 。6.小心插入梳子，在电泳前至少 60min打开开关，以便电泳缓冲液在 60达到平衡。7.待电泳缓冲液温度升至 60,关掉开关，打
19、开盖子，待凝胶聚合完成后，拔出梳子，清洗加样孔，将胶板系统放入电泳槽内。8 PCR产物 5l 和 loading buffers5l,混合后注射针上样,盖上盖子，打开开关。9.打开电源，电泳：200V 3.5h。10.电泳完毕后，用镊子敲开一侧玻璃板，将胶置于染色盘中，用 1xTAE buffer轻轻冲洗摇动，使胶与玻璃板脱离。11.将胶置于盛有 lxTAE buffer的染色盘中，待染色。12 .将稀释 10000倍的 SYBR Green I约 25ml倒入染色盘中置于摇床上染色 45 min后，在 Bio-Rad公司的凝胶成像系统进行拍照并分析染色。1.2.3 PCR 反应程序1.2.3
20、.1 16S rDNA V3片段的 PCR 扩增设计细菌的 16S rDNA序列 V3片段扩增的通用引物。引物选用 341f-GC（CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG）和534r（ATTACCGCGGCTGCTGG） ，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。反应体系：PCR Master Mix 12.5l，每种引物 1l（10pmol -1） ，1.5l 的发酵蔬菜总 DNA，加 ddH 2O 至终体积 25 l。反应程序：94预变性 5 min，94 30s，48.830 s，7245s，728min,35
21、个循环,最后于 4恒定保存。取 PCR 产物各 5l，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，Bio-Rad 公司凝胶成像系统观察。1.2.3.2 切胶回收用无菌手术刀将 DGGE凝胶上的特征条带切下并置于无菌 PCR管中，用无菌枪头将回收条带胶条碾碎，加约 40l 去离子水于 PCR管中 4过夜。1.2.3.3 16S rDNA V3片段的二次 PCR 及产物回收引物 341f（CCTACGGGAGGCAGCAG） ，534r（ATTACCGCGGCTGCTGG） ，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。反应体系：PCR Master Mix 12.5l，每种引物 1l（10pmol -1） ，取 2
22、.3.5的产物 1.5l 为模板，加 ddH 2O 至终体积 25 l。PCR反应程序同 2.3.3PCR 产物于1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，回收目的条带，操作步骤参见大量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒。51.2.3.4 细菌16S rDNA V 3片段的克隆测序1.2.3.5 纯化PCR产物的连接经纯化后的PCR产物（即2.3.6的产物）与pGM-T Vector进行连接，连接反应体系参照pGM-T克隆试剂盒操作说明如下：表 1.3 连接的反应体系Table 2.2 Reaction systerm of linkage试剂 加样量目的PCR片段 6lpGM-T Vector(50ng/l)
23、1l10xT4 DNA Ligation Buffer 1lT4 DNA Ligase 1lddH2O 补足到10l混匀后，16过夜。1.2.3.6 转化在超净台内将10l连接产物加入到装有90l感受态细胞的1.5mL离心管中，轻轻混匀，冰上静置30min，42热击90s，迅速静置于冰上2-3min，加入250-500l的LB(不含抗生素)液体培养基，混匀，37150r/min振荡培养45min，将100l已转化的感受态细胞涂布于含氨青霉素(100l/ml)IPTG和X-Gal的LB平板上，于37倒置过夜培养。1.2.3.7 检测（1）快速检测：操作步骤参照重组菌落PCR鉴定试剂盒如下1.按以
24、下体系配好含有引物的Taq MasterMix反应液。表1.4 反应体系Table 2.3 Reaction systerm试剂 加样量T7 Primer(10M) 1lT3 Primer(10M) 1l2xTaq MasterMix 10lddH2O 8l2.将过夜培养的平板上的菌落编号后，使用灭菌的牙签挑取一部分单菌落加入上述反应液，剧烈振荡使菌落充分分散到反应液中。3.短暂离心收集管中的液体后，进行PCR反应。4.PCR反应循环的设置：94预变性 3min，94 30s，5530 s，720.5-1min，72 5min，30个循环。5.结果检测：反应结束后取5l反应产物，琼脂糖凝胶电泳
25、检测。（2）常规检测：将得到的白色菌落接种1-5mlLB（含有终浓度50-100g/ml的氨苄青霉素）培养基，37摇床振荡培养过夜，保存菌种后提取质粒，鉴定插入片段是否正确。提取质粒时按照质粒小提试剂盒操作说明书(TIANGEN)进行。1.2.3.8 测序在超净工作台用灭菌枪头挑取经检测为阳性的白色菌落于已装有1ml灭菌的液体LB（含氨苄青霉素）6培养基的2ml离心管中，150rpm振荡，37温育2h，菌液混浊后，送至华大基因进行测序。1.2.4 DGGE图谱分析方法DGGE指纹图谱分析借助于 Bio-Rad公司的凝胶成像系统进行条带判读，并用 Quantity One software进行分
26、析。1.2.5 DGGE 条带结构多样性分析使用 Quantity One软件进行 DGGE条带分析，每个条带的位置和相对光密度值被该软件自动分析确定。为了最大程度的降低 DGGE过程中不同样品间 DNA上样浓度的差异，每个条带的光密度峰值除以该条带所在泳道所有条带光密度峰值的平均值进行数据的标准化处理。每条泳道内的条带数量用以评价物种丰富度(Species Richness)，并通过条带相对密度值计算物种均匀度(Species Evenness)及物种多样性（Shannon） 6。多样性指数（H） 、均匀度指数（E）及丰富度指数（R）的计算公式：H=-(ni/N)In(ni/N) （2.1）
27、E=H/InS (2.2)R=S-1/InN (2.3)式中，ni 为单一条带的峰面积，N 为某一泳道所有峰面积，S 为某一泳道的总条带数。1.2.6 相似性聚类分析使用 Quantity One软件的 UWPGA(Unweighted Pair Group Method using Arithmetic averages)方法对 DGGE图谱进行相似性聚类分析“1.2.7 系统发育分析方法对测序结果进行去载体，目的片段的筛选，将得到的目的片段序列提交到 GenBank中进行 BLAST比对，获得与目的片段相似度高的序列，通过 MEGA4.0利用 Neighbor-Joining法建立 16S
28、 rDNA的的系统发育树，对其进行系统发育分析 6。2 第二章 结果与分析2.1 土壤微生物总 DNA 的提取土壤总 DNA的提取按照 MO BIO 公司生产的土壤 DNA提取试剂盒步骤提取。将土壤样品提取所得的 DNA 进行 1%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图 2.1。从图中电泳结果可见，各个土壤样品获得的土壤微生物基因组总 DNA 条带清晰可见，纯度较高，符合 DGGE 分析的 DNA 质量要求1。 图 2.1 土壤总 DNA 琼脂糖凝胶电泳图 72.2 土壤样品基因组 DNA 的 PCR 扩增 设计细菌的 16S rDNA序列 V3片段扩增的通用引物。引物选用 341f-GC（CGCCC
29、GCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG）和534r（ATTACCGCGGCTGCTGG） ，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。由于土壤中含有大量的腐殖质成分，在提取纯化过程中无法完全除去。如果直接以提取的总 DNA 作为模板进行扩增，扩增效率较低，无法满足下一步的 DGGE 分析，本试验采用稀释模板和利用巢氏 PCR（nest-PCR） 进行扩增的方法加以解决。用稀释（土壤总 DNA 稀释 50 倍，可培养细菌总 DNA 稀释 100 倍）过的总 DNA 作为模板以 341f（CCTACGGGAGGCAGCAG）和 534
30、r（ATTACCGCGGCTGCTGG）为引物扩增出条带后，再以其为模板，以 341f-GC 和 534r 为引物进行第 2 次 PCR 扩增，获得特异 16S rDNA V3 区扩增片段 2。图 2.2 PCR扩增产物的电泳条带2.3 微生物的 DGGE 凝胶图谱的分析及比较 土样中直接提取 DNA，通过 PCR扩增 16S rDNA V3 区片段后，进行 DGGE 凝胶电泳，获得微生物的 16S rDNA V3 区 DGGE 凝胶图谱，利用 Quantitiy One 对图谱进行分析比较。 图 2.3 DGGE 电泳图谱 DGGE 模式图 利用 Quantity One DGGE 凝胶图谱
31、进行分析，结果见图 4.5是以样品 3 为标准做出 5 个样品的泳道识别图。泳道中的条带粗细不一，对应其在 DGGE 胶上的密度大小不同。密度大，则条带比较粗8黑；密度小，则条带比较细。图中显示共有 29 类条带，1 号、19 号和 20号、21 号条带在每个样品中均出现，26 号、28 号条带出现在 4个样本中，且 1号、 13 号条带在每个泳道中都较粗。7 号和 14 号条带也被视为比较特征的条带统计图中分离的条带数，从微生物 DNA 样品中共分离得到 29条不同条带，说明 5个土壤样品中共检测到 29种不同的微生物 DNA 信息。不同样品间微生物种群丰富程度不同，各个采样点分离条带数占总
32、条带数的比率为 38.5%-61.1%。 其中 3号样品的条带数最多，一共有 20条，5 号样品次之，共有 19条条带，1 号样品 14条条带，2 号样品 17条条带，4 号 16条条带。虽然微生物 DNA 样本来源于同一采样点原始土壤样品，但是 5个样品的电泳图谱在电泳条带数、条带分布及条带显色亮度方面都有较大差异 24-25。2.4 DGGE 条带结构多样性分析表 2.4 熏蒸剂熏过的土壤样品中细菌微生物群落结构特征从结果的统计来看，土壤微生物的丰富度、均匀性和多样性均受到一定程度地影响。多样性总体来说是有减小的趋势，其中 1号样品和 4号样品减小的比较明显，1 号样品减小的最为明显，说明
33、 1-3二氯丙烯混合式（27g/m2）对土壤的处理效果最为明显，对多样性的影响最大，3 号样品是个例外，多样性没有减小反而略有增加。在对均匀度的分析中我们可以看出，均匀度总体上有减小的趋势，但是其中的 4号是一个例外，没有减小反而增大 3，说明不同的熏蒸剂处理对于土壤中的微生物的均匀度的影响有很大的区别，溴甲烷（50g/m2）处理后，土壤中的微生物的均匀度增大，1-3 二氯丙烯混合式（27g/m2） 、1-3 二氯丙烯顺式（27g/m2） 、1-3 二氯丙烯反式（27g/m2）处理后均匀度均减小，其中1号即用 1-3二氯丙烯混合式（27g/m2）处理后均匀度减小的最为明显。对丰富度的分析中可以看出，总体上有减小的趋势，但是也有例外，3 号样品即用 1-3二氯丙烯反式（27g/m2）处理过的土壤样品微生物细菌丰富度增大，1 号、2 号、4 号样品结果均减小，其中 4号样品即溴甲烷（50g/m2）处理过的土壤中微生物细菌的丰富度减小的最为明显 4。样品 Shannon指数H均匀度E丰富度R1 3.882933 1.234674 20.903162 4.051107 1.274713 23.903923454.2819443.9955244.2336491.2850181.3569731.33215127.9080118.9051623.90572
