实验八_DNA的限制性内切酶酶切和鉴定

1、 质粒DNA 5l 4U/ul EcoRI 1l 掌型离心机混匀，37水浴反应50min,操作步骤（改动）,EcoR I的作用模式图:,产生5 突出粘性末端,*GAATTC*CTTAAG*,5,3,5,3,EcoR I,*G,*CTTAA,5,3,OH,P,AATTC*,G*,3,5,P,OH,5,5,EcoR I,Bcl-2 (1.9kb),pBS (2.96kb),pBS-Bcl-2 (4.86kb),Bcl-2重组质粒的酶切模式图,4.点样： 4 ul载样buffer+酶切产物，取其中24 ul上样 2 ul载样buffer +10ul 未酶切的质粒 1 ul载样buffer +5ul DNA Marker （点样孔置负极端）,3.倒胶：胶。

2、5,3,EcoR I,*G,*CTTAA,5,3,OH,P,AATTC*,G*,3,5,P,OH,5,5,EcoR I,Bcl-2 (1.9kb),pBS (2.96kb),pBS-Bcl-2 (4.86kb),Bcl-2重组质粒的酶切模式图,1.酶切: 20ul反应体系组分 加入体积灭菌双蒸水 11ul10buffer H(含BSA） 2ul质粒DNA 5ul10U/ul EcoRI 2ul掌型离心机混匀，37水浴反应1h,操作步骤（改动）,4.点样：1 ul含SYBR Green I的载样buffer +5ul酶切产物或+5ul 未酶切的质粒, 混匀。
（点样孔置负极端）,3.倒胶：胶冷却至60左右(不烫手)，缓缓倒入电泳槽 (先胶布封口，放好梳子)。
,2.制胶(0.8%)：称取0.48g琼脂糖倒入三角瓶中，加入1TAE缓冲液60ml，微波炉加热至沸腾，摇匀，至无颗粒。
,5.电泳：稳压条件下。

3、的存在。
类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的 DNA，而类酶在识别位点上切割 DNA 分子,然后从底物上解离。
类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。
绝大多数类限制酶识别长度为 4 至 6 个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如 EcoR识别六个核苷酸序列:5- GAATTC-3),有少数酶识别更长的序列或简并序列。
类酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割,产生平末端的 DNA 片段(如 Sma:5-CCCGGG-3);有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的 DNA 片段称粘性未端, 如 EcoR切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。
5GAATTC3 5G AATTC3 ；3CTTAAG 5 3CTTAA G5 。
Pvu I 的识别序列 53 5 3&#。

4、AG33TAGCTC5三、实验材料1、仪器：水浴锅、制冰机、离心机、电泳设备、各式移液枪、核酸紫外检测仪等。
2、1.5ml 离心管、移液枪枪头等。
3、DNA 样品：上一个实验获得的质粒 DNA4、限制性内切酶 Xho I 和 EcoR I（Takara）四、实验步骤酶切体系：质粒 DNA 5ulEcoR 1ulXhol 1ul2Buffer H 2ulSw 11ulTotal 20ul1、用微量移液枪（20 微升）依次吸取 SW、10 倍酶切缓冲液、DNA、EcoR I、Xhol I。
2、盖紧上述两个 1.5ml 离心管的盖子，在振荡器上充分混匀 2 秒钟，立即于离心机内离心一下，以将管壁上的液体集中于管底。
3、将离心管放置 37水浴锅中反应 3 小时。
在酶切反应的同时，制备 1.0%的琼脂糖凝胶，并准备好电泳装置。
五、实验结果很明显 17 组由于样品里的目的片段 DNA 量太少，所以没有检测到。
观察其他组的结果可知，酶切后产生 2 条条带，由于质粒。

5、TAGCTC5,三、实验材料,仪器：水浴锅、制冰机、离心机、电泳设备、各式移液枪、核酸紫外检测仪等。
1.5ml离心管、移液枪枪头等。
DNA样品：上一个实验获得的质粒DNA 限制性内切酶Xhol I和EcoR I（Takara）,四、实验步骤,酶切体系：,质粒DNA 5ul EcoR 1ul Xhol 1ul 2Buffer H 2ul Sw 11ul Total 20ul,用微量移液枪（20微升）依次吸取 SW 10倍酶切缓冲液 DNA EcoR I Xhol I,盖紧上述两个1.5ml离心管的盖子，在振荡器上充分混匀2秒钟，立即于离心机内离心一下，以将管壁上的液体集中于管底。
将离心管放置37水浴锅中反应3小时。
在酶切反应的同时，制备1.0%的琼脂糖凝胶，并准备好电泳装置。
,五、实验结果,根据电泳结果，描述酶切的结果与效果。
,M 1 2,4900bp,1518bp,Analysis of recombinant expression。

6、而类酶在识别位点上切割DNA分子,然后从底物上解离。
类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。
类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。
绝大多数类限制酶识别长度为4至8个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列。
,GAATTC CTTAAG,EcoR,AAGCTT TTCGAA,Hind,5,5,5,5,质粒pUC18的物理图谱,三、材料 重组质粒；EcoRI酶及其酶切缓冲液: 购买成品； Hind酶及其酶切缓冲液: 购买成品;琼脂糖(Agarose) 。
四、仪器 移液器及吸头，水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉或电炉,紫外透射仪。
,五、试剂 1、 5TBE电泳缓冲液：配方见第一章。
2、 6电泳载样缓冲液：0.25 溴粉蓝，40(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于 3、 溴化乙锭(EB)溶液,六、操作步骤1、 将清洁干燥并经灭菌的epp。