1、DNA 的限制性内切酶酶切分析,实验十二,限制性内切酶(Restriction Endonuclease,RE): 由细菌自身产生，能识别双链DNA分子中特定的碱基顺序，以内切方式水解核酸中的磷酸二酯键，产生粘性末端或平头末端,实验原理,EcoR I的作用模式图:,产生5 突出粘性末端,*GAATTC* *CTTAAG*,5,3,5,3,EcoR I,*G,*CTTAA,5,3,OH,P,AATTC*,G*,3,5,P,OH,5,5,EcoR I,Bcl-2 (1.9kb),pBS (2.96kb),pBS-Bcl-2 (4.86kb),Bcl-2重组质粒的酶切模式图,1.酶切: 20ul反应
2、体系组分 加入体积灭菌双蒸水 11ul10buffer H(含BSA） 2ul质粒DNA 5ul10U/ul EcoRI 2ul掌型离心机混匀，37水浴反应1h,操作步骤（改动）,4.点样：1 ul含SYBR Green I的载样buffer +5ul酶切产物或+5ul 未酶切的质粒, 混匀。（点样孔置负极端）,3.倒胶：胶冷却至60左右(不烫手)，缓缓倒入电泳槽 (先胶布封口，放好梳子)。,2.制胶(0.8%)：称取0.48g琼脂糖倒入三角瓶中，加入1TAE缓冲液60ml，微波炉加热至沸腾，摇匀，至无颗粒。,5.电泳：稳压条件下90V电泳，待染料(指示剂)移动至胶前沿2cm处停止电泳(约30
3、min)。（不超过5V/cm胶长度） 6.观察结果：紫外分析仪上254nm观察，DNA存在处显绿色荧光条带 ，观察酶切后与未酶切质粒的DNA带位置。,100bp DNA Marker,已酶切质粒,未酶切质粒,3000bp,1500bp,1000bp,500bp,2.96kp,1.9kp,点样孔,注意事项,1. 第一步确保样品加到反应体系中,若有粘壁，用掌型离心机离心到底部!2. 当样品在37 水浴时，要盖紧盖子，否则水汽进入管内，使反应体积大大增加，造成酶切失败3. RE一定要在低温(20)下贮存(含50甘油) ，每次吸取后应放在冰盒，用完后立即放在-20，新购的大包装酶应先分装,4.倒胶时不
4、能有气泡，若有需立刻用枪尖吸掉或牙签挑破 5.点样孔置负极一端，点样时也应检查点样孔中有无气泡，电泳前正确连接正负极 6.电泳时电场强度不超过5V/cm胶长,思考题：,DNA的纯度会不会影响酶切产物的质量？如果会，请说明原因。 比较本实验酶切后与未酶切质粒的电泳图谱，综合前两个实验，分析可能的原因,1. DNA中的DNase、蛋白、RNA、 SDS 、EDTA、酚、氯仿和乙醇等杂质都会影响酶切效果。2. DNA中的杂DNA、蛋白可与RE非专一性结合使酶活性降低，另外杂DNA 也竞争酶的切口，往往造成切不动。3. DNA中的盐离子（如Mn2+、Cu2+、Co2+和Zn2+等）与有机溶剂（如酚、氯仿和乙醇等）都可抑制限制酶的活性或使限制酶失活或造成DNA切不动或使限制酶切割一些非特异序列(*活性)。,分子克隆,多莉羊的克隆,个体克隆,
