1、DNA 的限制性内切酶酶切分析,实验九,1.酶切: 20ul反应体系 组分 加入体积 灭菌双蒸水 12l 10buffer H(含BSA) 2l 质粒DNA 5l 4U/ul EcoRI 1l 掌型离心机混匀，37水浴反应50min,操作步骤（改动）,EcoR I的作用模式图:,产生5 突出粘性末端,*GAATTC*CTTAAG*,5,3,5,3,EcoR I,*G,*CTTAA,5,3,OH,P,AATTC*,G*,3,5,P,OH,5,5,EcoR I,Bcl-2 (1.9kb),pBS (2.96kb),pBS-Bcl-2 (4.86kb),Bcl-2重组质粒的酶切模式图,4.点样： 4
2、 ul载样buffer+酶切产物，取其中24 ul上样 2 ul载样buffer +10ul 未酶切的质粒 1 ul载样buffer +5ul DNA Marker （点样孔置负极端）,3.倒胶：胶冷却至70左右(不烫手背)，加核酸染料5ul ，缓缓倒入电泳槽 (先胶布封口，放好梳子),2.制胶(0.8%)：称取0.32g琼脂糖倒入三角瓶中，加入1TAE缓冲液40ml（已完成），微波炉中火加热2分钟至沸腾，摇匀，至无颗粒。,5.电泳：稳压条件下150V电泳，待溴酚蓝移动至接近胶前沿时停止电泳(约15min)。 6.观察结果：紫外分析仪上254nm观察，DNA存在处显亮绿色荧光条带，观察酶切后与
3、未酶切质粒的DNA带位置。,100bp DNA Marker,已酶切质粒,未酶切质粒,3000bp,1500bp,1000bp,500bp,2.96kp,1.9kp,点样孔,注意事项,1. 第一步确保样品加到反应体系中,若有粘壁，用掌型离心机离心到底部! 2. 当样品在37 水浴时，要盖紧盖子，否则水汽进入管内，使反应体积大大增加，造成酶切失败 3. RE一定要在低温(20)下贮存(含50甘油) ，每次吸取后应放在冰盒，用完后立即放在-20，新购的大包装酶应先分装,4.倒胶时不能有气泡，若有需立刻用枪尖吸掉或牙签挑破5.点样孔置负极一端，点样时也应检查点样孔中有无气泡，电泳前正确连接正负极6.每种RE均有专用buffer,如遇两种酶酶切可选择通用buffer进行双酶切,否则应分开切,
