1、实验八 DNA的限制性内切酶酶切和鉴定,一、实验目的 掌握限制性内切酶的特性。 了解限制性内切酶的用途。,二、DNA限制性内切酶概述和分析 限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。它可分为三类:类和类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而类酶在识别位点上切割DNA分子,然后从底物上解离。类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。类中的限制性内切酶在分子克隆中
2、得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。 绝大多数类限制酶识别长度为4至8个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列。,GAATTC CTTAAG,EcoR,AAGCTT TTCGAA,Hind,5,5,5,5,质粒pUC18的物理图谱,三、材料 重组质粒；EcoRI酶及其酶切缓冲液: 购买成品； Hind酶及其酶切缓冲液: 购买成品;琼脂糖(Agarose) 。四、仪器 移液器及吸头，水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉或电炉,紫外透射仪。,五、试剂 1、 5TBE电泳缓冲液：配方见第一章。 2、 6电泳载样缓冲液：0.25 溴粉蓝，40(w/v) 蔗糖水溶液，
3、贮存于 4。 3、 溴化乙锭(EB)溶液,六、操作步骤1、 将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管(最好0.5ml)编号,用微量移液枪分别加入质粒DNA （5-14 l）和相应的限制性内切酶反应10缓冲液2l,再加入重蒸水使总体积为18l,将管内溶液混匀后加入EcoRI和Hind各1l,用手指轻弹管壁使溶液混匀,也可用微量离心机甩一下,使溶液集中在管底。此步操作是整个实验成败的关键,要防止错加，漏加。使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。2、 混匀反应体系后,将eppendorf管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上）,37水浴保温1-3小时,使酶切反应完全。3、 每管加入2l 0.1mol/L EDTA(pH8.0),混匀,以停止反应,置于冰箱中保存备用。,七、电泳检测在1琼脂糖凝胶上进行电泳，EB染色，紫外 透射仪下观察或拍照。,思考题： 写出EcoRI和 Hind两种内切酶消化产物的末端序列。 什么是粘性末端和平末端？ 限制性内切酶在基因工程中有什么作用？,
