实验-大肠杆菌感受态细胞的制备及转化

1、大肠杆菌感受态的制备、 重组DNA的转化和抗药性筛选,中山医学院,朱文博,大肠杆菌感受态的制备及重组体转化 （p93）,1 感受态(competent),宿主细胞处于容易吸收外源性DNA的状态成为感受态； 处于感受态的细胞称为感受态细胞.,1.1 制备感受态细胞的原理,正常细胞都有细胞膜（细菌还有细胞壁）作屏障，对外源分子选择性接受。在实验中通过一定的理化条件使细胞膜通透性增大，处于感受态。,1、CaCl2转化程序法：传统方法,转化效率能达到5106-2107转化子/g质粒DNA,简单、快速、重复性好、菌株适用范围广。2、电穿孔转化法：通过高强度的电场作。

2、 大肠杆菌热击感受态细胞的制备、注意事项和转化 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 大肠杆菌感受态细胞制备的原理 ： 大肠杆菌自然条件下很难进行转化，其主要原因是转化因子的吸收较为困难。在转化实验中， 通常先采用人工的方法制备感受态细胞，代表性的方法之一是Ca 2+ 诱导法。 感受态形成后， 细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA 的结合和加工等。细胞表 面正电荷增加。

3、大肠杆菌的 CaCl2 化学感受态细胞制备和转化准备工作：1、LB 琼脂平板若干。2、50mL 离心管若干，加满超纯水后于 12120 分钟灭菌备用。3、含有 50mL LB 液体培养基的 250mL 三角瓶若干，12120 分钟灭菌烘干。4、1.5mL 离心管若干，12120 分钟灭菌烘干。5、22灭菌甘油溶液：22mL 甘油加入 78mL 超纯水，12120 分钟灭菌，保存于 4。试剂：1、100mL1mol/LCaCl 2 溶液：14.7gCaCl 2.2H2O 用超纯水配制成 100mL 贮存液，灭菌备用，保存于 4冰箱。2、100mL0.1mol/LCaCl 2 溶液：10mL1mol/LCaCl 2 溶液加 90mL 灭菌超纯水混匀，保存于 4冰箱。3、。

4、大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 大肠杆菌感受态细胞制备的原理 大肠杆菌自然条件下很难进行转化 其主要原因是转化因子的吸收较为困难 在转化实验中 通常先采用人工的方法制备感受态细胞 代表性的方法之一是Ca2 诱导法 感受态形成后 细胞生理状态会发生改变 出现各种蛋白质和酶 负责供体DNA的结合和加工等 细胞表面正电荷增加 通透性增加 形成能接受外来的DNA分子的受体位点等 Ca2 诱导DNA对大肠杆。

5、基因工程实验技术,实验三： 大肠杆菌感受态细胞的制备和质粒DNA转化,实验目的和要求,学习CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞； 学习用热激法将外源基因导入感受态细胞。实验原理 实验材料 实验步骤 预期结果 实验安排 注意事项,一、实验原理（CaCl2法、热激法）,1、几个概念 转化( Transformation )是将异源 DNA 分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究的基本实验技术。 转化过程所用的受体细胞一般是限制性修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，如D。

6、1.概 述在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内, 但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的 mob 基因, 因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源 DNA。转化(Transformation)是将外源 DNA 分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段, 它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R,M),它可以。

7、大肠杆菌感受态细胞的制备原理、步骤以及重组质粒转化一、 目的 1.了解感受态细胞生理特性及制备条件，掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。 2.掌握质粒 DNA 转化大肠杆菌的方法，了解转化的条件和利用半乳糖苷酶基因插入失活选择重组质粒 DNA 的原理。 二、原理 （一）大肠杆菌感受态细胞制备的原理 所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源 DNA 而不将其降解的生理状态。感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体 DNA 的结合和加工等。细胞。

8、大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理及注意事项 1、 感受态细胞的概念 重组 DNA分子体外构建完成后必须导入特定的宿主（受体细胞）使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组 DNA分子的转化。在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。 所谓的感受态：即指受体或者宿主最易接受外源 DNA片段并实现其转化的一种生理状态，是由受体菌的遗传性状所决定的同时也。

9、大肠杆菌感受态细胞的制备 转化与鉴定 一 目的 把体外重组的DNA引入受体细胞 二 原理 一 遗传物质的传递 二 受体菌的选择与改造 三 感受态细胞的制备 氯化钙法 1 划平板培养菌种2 挑单菌落培养过夜3 菌体的扩大培养 以下步骤均在冰浴中进行 4 4 离心 4000rpm 10min 弃去上清 用冰浴的0 1MMgCl225ml悬浮30min5 4 离心 4000rpm 10min 弃去上清 。

10、大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒DNA的转化,实验目的 实验原理 实验试剂 实验步骤 注意事项,了解转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。 学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。 学习将外源质粒 DNA 转入受体菌细胞并筛选转化体的方法。,一、实验目的,二、实验原理,感受态细胞(Competent cells)受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法， CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。,转化（transformation） 是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞。

11、3.大肠杆菌电转化及电转感受态细胞的制备电转化法是利用瞬间高压在细胞上打孔，同时，DNA 在电场力的作用下进入细胞，随后细胞复苏和弥合，从而实现质粒 DNA 的物理转移。为避免电击时出现“击穿”，即产生电流，细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。转化效率为 10910 10 转化子/g DNA。3.1感受态细胞的制备（1）感受态细胞及材料准备同钙转化感受态细胞的制备相同。（2）选合适的大肠杆菌在 4，3000 rpm 下离心 10min，弃上清液（如需要，沉淀可在4的 10%甘油中保存 12 天）。（3）弃上清，离心管中加入少量 ddH2O，轻柔的悬浮沉淀后，。

12、实验三 大肠杆菌感受态细胞的制备【课前预习】1、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的基本原理是什么？2、大肠杆菌感受态细胞的制备可以采用哪些方法？【目的要求】1、了解感受态细胞生理特性及制备条件；2、掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法；【基本原理】 所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源 DNA 而不将其降解的生理状态。它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。cAMP 可以使感受态水平提高一万倍，而 Ca2+也可大大促进转化的作用。。

13、 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化（原理）感受态细胞的概念重组 DNA 分子体外构建完成后，必须导入特定的宿主（受体）细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组 DNA 分子的转化。在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。 1、 感受态细胞的概念所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源 DNA 片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的。

14、大肠杆菌感受态细胞的制备、 重组DNA的转化、克隆筛选,1. 实验目的和要求 通过本实验学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞和外源质粒DNA转入受体菌细胞的技术以及筛选转化体的技术。了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。,2. 相关知识及原理感受态细胞(Competent cells): 受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。,转化（transformation）：是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状。

15、 第三章 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 第一节 概 述 在自然条件下 , 很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内 , 但在人工构建的质 粒载体中 , 一般缺乏此种转移所必需的 mob 基因 , 因此不能自行完成从一个细胞到另一个细 胞的接合转移。 如需将质粒载体转移进受体细菌 , 需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以 摄取外源 DNA 。 转化 (Transformation 是。

16、大肠杆菌感受态细胞的制备和转化第一节概述在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的 mob 基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源 DNA。转化(Transformation)是将外源 DNA 分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性。

17、实验九，十 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化,在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需将对数生长期的细菌（受体细胞）经理化方法处理后，细胞膜的通透性发生暂时性改变，成为能允许外源 DNA 分子进入的细胞，称感受态细胞。,一. 实验原理,1. 概念,感 受 态 细 胞,转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分。

18、实 验 二,大肠杆菌感受态细胞的 制备及转化,内容一：大肠杆菌感受态细胞的制备,实验目的,实验原理,实验仪器、材料、试剂,实验步骤,1,2,3,4,注意事项,思考题,5,6,实 验 目 的,掌握感受态细胞的概念及其意义。掌握感受态细胞的制备原理与操作方法。,实 验 原 理,感受态：受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态。它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。制备感受态的细胞一般选择对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。常用的感受态制备方法包括KCl、CaCl2。