1、实验三 大肠杆菌感受态细胞的制备【课前预习】1、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的基本原理是什么？2、大肠杆菌感受态细胞的制备可以采用哪些方法？【目的要求】1、了解感受态细胞生理特性及制备条件；2、掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法；【基本原理】 所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源 DNA 而不将其降解的生理状态。它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。cAMP 可以使感受态水平提高一万倍，而 Ca2+也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的
2、关键。感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体 DNA 的结合和加工等。细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的 DNA 分子的受体位点等。 基因工程技术中最常用的是氯化钙转化技术，虽然对其基本原理仍然不完全清楚，但是比较认同的看法是，细菌处干 0、CaCl 2 低渗溶液中，细胞膨胀形成球状，转化混合物中的 DNA 形成抗 DNase 的羟基-钙磷酸复合物粘附与细胞表面，经 42短时间热冲击处理，促进细胞吸收 DNA 复合物，之后细菌在富含营养的培养基上生长，球状细胞复原并分裂繁殖， 重组质粒在转化的细菌中，表达目的基因，因而在选择性培养基平板中，可以选出阳性
3、细菌转化子。Ca 2+处理的感受态细胞，一般每微克 DNA 能转化 105-106 个细菌、环化的质粒 DNA 愈小，转化率愈高。环化的 DNA 分子比线性 DNA 分子转化率高 1000 倍。CaCl2 转化法的优点是：简单快速，重复性好，菌株适用范围广。另外，电击法也可用于转化过程，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依赖短暂的电击，利用瞬时高压电流（数千伏特）处理细胞悬浮液，使微生物细胞膜在高压电作用下发生去极化，产生微孔，悬液中溶解的核酸即可通过细胞膜上的空洞进入细胞内部，转化率最高达 109-1010 转化子/g 闭环 DNA。制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积 15%的无菌
4、甘油或-70 保存（有效期 6 个月）。【实验用品】 （一）仪器与器皿恒温振荡器、分光光度计、电动沉淀离心机、旋涡混合器、恒温培养箱隔、电热恒温、水浴锅、恒温摇床、普通冰箱、Eppendorf 管、转液管、平皿、涂布棒、微量取样器、微波炉、三角烧瓶、试管、刻度离心管、保温瓶、酒精灯等。（二）菌种大肠杆菌 DH5（rk - mk- rec-）（三）培养基与试剂1、LB 液体培养基（1%蛋白胨、0.5%酵母粉和 0.5%NaCl，pH7.5 。）2、100 mmol/ L CaCl 2 溶液3、氨苄青霉素溶液（50 毫克/毫升）4、CaCl 2-MgCl2（80mmol/l MgCl 2，20mm
5、o/l CaCl 2)溶液配制：储存液配制：5M CaCl2 配制：CaCl 22H2O 36.75g50mL H2O，37孵箱中放置过夜使之完全溶解，用除菌滤器过滤除菌；2M MgCl2 配制：MgCl 26 H2O 20.3g50mL H 2O，高压灭菌。工作液配制：0.1M CaCl2-MgCl2 配制： 10ml: 5M CaCl2 40ul +2M MgCl2 400ul + H2O 9.56ml【方法步骤】（一）大肠杆菌感受态细胞制备1、将大肠杆菌 DH5 接种于 LB 平板上活化，置于恒温培养箱中 37培养过夜。2、挑取一个直径约为 2 到 3 毫米的单菌落接种于一只装有 5 毫
6、升 LB 液体培养基的灭菌试管中，于 37C 下振荡培养过夜。3、 转移 0.5 毫升过夜培养物于一只装有 50 毫升 LB 培养基（接种量按菌液浓度而定，一般在 1%左右）的灭菌三角瓶中， 37C 下振荡培养 2 到 2.5 小时（此时细菌处于对数生长期）。4、取 1 毫升培养液以未接种的 LB 作空白对照，在分光光度计上测 OD600 的光密度值，约为 0.2-0.5 左右。5、 无菌条件下将上述 1 毫升菌液倒入 1.5 毫升 EP 离心管中（离心管应带盖并高压灭菌过），每组 2 支。室温下，4000 rpm 离心 5 分钟收集对数期细胞， 弃培养基，保留细胞沉淀。6、加入预冷的 100
7、mmol/L CaCl2-MgCl2 溶液(80mmol/L MgCl 2，20mmol/L CaCl2) 600 微升，用微量取样器轻轻吸冲底部沉淀菌体，使其悬浮后，把 2 支管转为 1 支，摇匀后于冰浴中放置 30 分钟。7、 4C 下，4000 rpm 离心 10 分钟收集细胞； 弃 MgCl2-CaCl2 溶液，保留细胞沉淀。8、再把菌体悬浮在 200 微升 100mmol/L CaCl2 的溶液中，并轻微打匀，冰浴放置 2 小时。此时，可以将制备的细胞直接转化，也可以将细胞放置在 4冰箱中，于 1-7d 内使用；也可以向细胞液中加入甘油，至甘油终浓度为 10%，-70长期保存。注：自
8、己制备的感受态细胞用作下次质粒转化实验中。【注意事项】 1、细胞生长状态和密度：不要用经过多次转接或储于 4的培养菌。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好。2、试剂的质量：所用的试剂，如 CaCl2-和 MgCl2 等均需是最高纯度的，并用超纯水配制。3、防止杂菌和杂 DNA 的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行，所有器皿和试剂都要高温灭菌。【实验结果】将自己制作的感受态细胞拍照记录；比较对照平皿和转化平皿，计算转化率；【实验讨论】感受态细胞制备时为什么要控制大肠杆菌的细胞生长期？【实验知识补充】 为了把外源 DNA（重组质粒）引入大肠杆菌，就必须先制备能吸收外来 DNA 分子 的感受态细
9、胞。在细菌中，能发生感受态细胞占极少数。而且，细菌的感受态是在短暂时间内发生。目前对感受态细胞能接受外来 DNA 分子的本质看法不一。主要有两种假说： 1、局部原生质体化假说细胞表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使 DNA 分子能通过质膜进细胞。证据有： （1）发芽的芽孢杆菌容易转化； （2）大肠杆菌的原生质体不能被噬菌体感染，却能受噬菌体 DNA 转化； （3）适量的溶菌酶能提高转化率。 2、酶受体假说感受态细胞的表面形成一种能接受 DNA 的酶位点，使 DNA 分子能进入细胞。证据是：（1）蛋白质合成的抑制剂如氯霉素，可以抑制转化作用； （2）细胞分裂过程中，一直有局部原生质化，但感受态只在生长对数期的中早期出现；（3）分离到感受态因子，能使非感受态细胞转变为感受细胞。目前对感受态细胞的转化理论尚未有统一结论，但是许多实验室一直进行探索，试图从实验中获得明确回答。有人根据 pBR322 质粒 DNA 对 E.coli K-12X1776 菌株的转化结果，认为：在许多研究室都发现 CaCl2 对受体菌处理，可提高转化效率几十倍，通常把细胞悬浮在 pH6.0 的 100mmol/L CaCl2 中，在冰浴条件下，放置过夜，转化率转高，但一过24 小时，转化率测恢复为原来的水平。
