1、实验九，十 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化,在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需将对数生长期的细菌（受体细胞）经理化方法处理后，细胞膜的通透性发生暂时性改变，成为能允许外源 DNA 分子进入的细胞，称感受态细胞。,一. 实验原理,1. 概念,感 受 态 细 胞,转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。,转 化,
2、转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R,M),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA分子的受体细胞)。,转 化,转化过程,RbCl(KCl)法，
3、 CaCl2法，电击感受态制备等RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但制备较复杂，不适合实验室用电击感受态细胞转化效率高，操作简便，但需电击仪CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15的无菌甘油于-70以下保存半年，因此CaCl2法使用更为广泛.,常用的感受态细胞制备方法,CaCl2法是以Mendel和Higa（1970）的发现为基础，其基本原理是：细胞处于 0 4 ， CaCl2 低渗溶液中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。转化混合物中的 DNA 形成抗 DNA 酶的羟基 - 钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经 42 90
4、 秒热激处理，促进细胞吸收 DNA 混合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型，如氨苄青霉素耐药（ Amp r ）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含 Amp 的选择性培养基上，倒置培养过夜，即可获得细菌菌落。,CaCl 2 法制备感受态细胞原理,提高转化效率的几个因素,细胞生长状态和密度质粒的质量和浓度试剂的质量防止杂菌和杂DNA的污染,细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于的培养菌，最好从70或-20甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5菌株的OD600
5、 为0.5时,细胞密度在5107 个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。,提高转化效率的几个因素,质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。1ng的cccDNA即可使50l 的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5。,提高转化效率的几个因素,试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处,防止杂菌
6、和杂DNA的污染： 整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管, tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染, 否则均会影响转化效率或杂DNA的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。,提高转化效率的几个因素,1）材料 E. coli DH5菌株； pBS质粒、 1.5ml 离心管（又称eppendorf管） Amp；,2）设备 恒温摇床，电热恒温培养箱，台式高速离心机，超净工作台，低温冰箱，恒温水浴锅，制冰机，分光光度计，微量移液枪， eppendorf管等。,二. 材料，设备及试剂,0.1mol/L的CaCl
7、2LB液体培养基LB固体培养基Amp母液：氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)母液：配成 100mg/ml水溶液, -20保存备用,3. 试 剂,三. 操作步骤,本实验以E.coli DH5a菌株为受体细胞,并用CaCl2处理,使其处于感受态,然后与质粒共保温,实现转化。由于质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr )，可通过Amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入质粒，则在含Amp的培养基上不能生长。能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了质粒。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。,受体菌的培养 1) 从LB平板上挑取新活化的E. coli D
8、H5单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37,180rpm振荡培养过夜；2) 将该菌悬液以1:30-100的比例接种于100ml LB液体培养基中，37振荡培养23小时至OD600在0.3-0.4左右 ;3) 无菌条件下取1.5 ml菌液到eppendorf管中，冰浴10min，4, 8000rpm离心5min;4) 彻底弃上清液，在冰浴上加入500ul预冷的无菌CaCl2 (0.lmol/L)使细胞悬浮；,5) 4 ,8000 rpm离心4min，弃上清液 (4,5步可重复1-2次）;6) 用100l预冷的无菌CaC12 (0.lmol/L) 重新悬浮细胞，冰上备用； 注：如果需要保
9、存，用80ul 预冷的无菌CaC12 (O.lmol/L)和20ul无菌的70%甘油悬浮细胞，液氮冷激10min后，-70以下保存备用。,2. 转化,取100l感受态细胞悬液，在冰浴中使其解冻，加入10l连接产物（或质粒DNA）(含量不超过50ng,体积不超过10l)，轻轻摇匀，冰上30-40min； A.质粒DNA组：10l pBS质粒DNA +100l感受态细胞悬液 B.空白对照组:10ul无菌水100l感受态细胞悬液,42水浴中热击90秒（勿摇动），热击后迅速置于冰上冷却2min；向管中加入400L LB液体培养基(不含Amp)，混匀后37，180rpm振荡培养40min，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr )；涂平板：将上述菌液摇匀后取100ul涂布于含Amp的筛选平板上，在菌液完全被培养基吸收后，37倒置培养皿培养1216h。,注意：1、含Amp的LB固体培养基的配制:将灭菌的LB固体培养基水浴溶解后冷却至60左右,加入Amp储存液,使终浓度为50-100ug/ml,摇匀后倒平板；2、1小时空间：转化后温浴45min左右，让抗性基因得以表达，再涂抗性平板,1.感受态细胞有何特点？如何保证它的质量？2.如阴性对照中长出菌，原因？3.还有哪些方法可以将外源基因导入受体细胞？各有什么优缺点？,四. 问题与讨论,
