1、基因工程实验技术,实验三： 大肠杆菌感受态细胞的制备和质粒DNA转化,实验目的和要求,学习CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞； 学习用热激法将外源基因导入感受态细胞。实验原理 实验材料 实验步骤 预期结果 实验安排 注意事项,一、实验原理（CaCl2法、热激法）,1、几个概念 转化( Transformation )是将异源 DNA 分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究的基本实验技术。 转化过程所用的受体细胞一般是限制性修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，如DH1、DH5、MM294、JM108/109、D
2、H5等， 常用 RM 符号表示。 转化方法：电击穿孔法、 CaCl2、 RuCl等化学试剂法感受态细胞(competent cell) ：用物理或化学方法处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源 DNA 分子通过时细胞的状态。转化细胞(转化子)：带有异源 DNA 分子的受体细胞( Transformant )。,2、CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞及热激转化：正在生长的大肠杆菌在0下加入到低渗的冰冷的氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀形成原生质球，并同加入在转化混合物中的外源质粒DNA或噬菌体DNA形成一种黏着在细胞表面上的对DNase抗性的羟基钙磷酸复合物。转移到42下作短暂的热刺激期间
3、，这种复合物便会被细胞吸收。,抗Amp,宿主细菌,含Amp培养基,转化子的筛选,3、影响感受态细胞转化效率的因素有：（1）细菌的生长状态和密度OD600=0.30.5，细菌生长处于对数期或对数前期。 （2）质粒DNA 数量：质粒DNA不超过感受态细胞体积的5%。 大小：分子量越大，转化效率越低，超过30kb的质粒DNA很难转化成功。 构型：超螺旋的DNA具有较高的转化效率，重组DNA效率低一些，环状DNA相比线性DNA转化效率高一些。（3）所用试剂纯度、质量、器皿的洁净程度（4）防止杂菌和其它外源 DNA 的污染。,二、实验材料,l、仪器和材料 大肠杆菌(E. coli JMl09菌株) 恒温
4、培养箱、恒温摇床、接种环、涂布器、离心机、30 mL离心管、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、Ep离心管(1.5 mL微量离心管)、加样器、1000 L和200 L吸头。 2、试剂 (1) LB琼脂平板： (2) LB液体培养基： (3) 0.1mol/L CaCl2溶液 (4) 自提质粒等,三、实验步骤,(一) 菌种的纯化及扩大培养(二) CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞 (三) 质粒DNA转化感受态细胞,(一)菌种的纯化及扩大培养（无抗生素的LB ）,冻存菌在新鲜LB平板上，划线，37培养1620 h。,挑一单菌落接种到3 mL LB液体培养基中，37培养过夜,取l mL培养液加到100 mL
5、 LB液体培养基中，37摇床培养23 h ，当其OD600为0.30.5时(细胞数108/mL)，立即取出，冰浴1015 min。,(二) CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞,l、将菌液转移到两个冰冷离心管中，平衡后于4，5000 r/min离心10 min，弃尽上清(可用加样器将残余液体尽量去净)。收集沉淀2、各加10 mL 0.1 mol/L冰冷的无菌CaCl2溶液重悬细胞，于冰上放置15 min于4，5000 r/min离心10min，弃上清。 CaCl2洗涤沉淀3、各加1.4mL 0.1 mol/L冰冷的CaCl2-10%甘油溶液，重悬细胞，于冰上放置2 min。即制备成感受态细胞悬液
6、。制成悬液4、取此细胞悬液200 L分装到Ep离心管中，可于冰上保存一周；也可置于液氮速冻后于-80冰箱长期保存。分装保存,(三) 质粒DNA转化感受态细胞,1取5 L质粒DNA(50 ng)加入到分装后的200 L的感受态细胞中，吹吸轻轻混匀，置于冰上30min； 2将感受态细胞42热休克恰好90 s，迅速放入冰中，冰浴2min； 3转化物涂布于LB琼脂平板上(含Amp)，待液体吸收完全后，37倒置培养1216 h； （可梯度涂板） 4、对照组（三组）： 200 L感受态细胞+ 5 L ddH2O水，同上进行转化反应，只取5L菌液+ 适量ddH2O稀释后涂布于不含Amp的LB平板上。 制备的
7、感受态细胞200 L涂布于有Amp的LB平板； 5L质粒DNA + 适量ddH2O稀释后涂布于有Amp的LB平板； 5结果观察。,四、预期结果,对照组（1）：在无Amp平板上产生大量菌落，计数； 对照组（2）：在有Amp平板上不生长； 对照组（3）： 在有Amp平板上不生长； 转化组：被质粒转化的感受态细胞，有Amp平板上出现转化细胞形成的单菌落，即转化子。感受态细胞总数对照组1菌落数稀释倍数（1）菌液总体积涂板菌液体积 转化子总数菌落数稀释倍数（1）转化反应原液总体积涂板菌液体积 感受态细胞转化效率转化子总数感受态细胞总数,五、实验安排,8:309:15 讲课 9:159:30 从小试管大肠
8、杆菌培养物中取1mL接种至装有100mL LB培养基的三角瓶中，摇床培养2小时。注意酒精灯旁无菌操作。（每4人一支试管，接种一个三角瓶） 9:3010:30 彻底熔化LB固体培养基，先倒1块无Amp的平板，培 养基稍冷却，加200L Amp（终浓度50g/mL），混匀，倒7块含Amp的平板。放置不动，待凝固。注意无菌操作。（每4人200mL LB固体培养基，倒8块平板，其中1块无Amp， 7块含Amp ） 10:3011:30 午饭 11:3012:30 制备感受态细胞，分装7管，200L /每管。 12:3013:30 质粒DNA的转化 明日8:30 观察实验结果，计数转化子及感受态细胞，实
9、验报 告上计算出感受态细胞转化效率。,五、注意事项,1、冰上操作； 2、无菌操作； 3、重悬细胞时操作要轻； 4、实验应设有阳性对照，以估算转化效率；应设立阴性对照，以消除可能的污染及查明可能的 失败原因。 5、离心管一定要平衡后（无菌操作）才能放入离心机进行离心。,聚合酶链式反应技术设计题,已知下面一段序列，请在预习报告中设计出扩增该段序列的一对引物，反应体系及反应程序。 GTAGTCATATGCTTGTCTCAAAGATTAAGCCATGCATGTCTAAGTAAAAGCAATTTTTACAGCGAAACTGCGAATGGCTCATTAAATCAGTTATGATCTACATGGCAATGT
10、ATTTTTTACTATTGGATAACCGTGGTAATTCTAGAGCTAATACATGCAAAAAAGGGGTGCTTTACGGCACTCTGCACTTATTAGATCAAAGCCAACAGCCTGGAAACAGGTTTCTTTTGGTGAATCATAATAATTAAGCGGATCGCATGGCCTTGTGCCGGCGACGGTTCATTCGATTTTCTGCCCTATCAGGCTTTTGATGGTAAGGTAGTGGCTTACCATGGCTATCACGGGTGACGGGGAATAAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGG
11、CAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCCGATTCGGGGAGGTAGTGACAATAAATAACAATGCAGAGCCTTTCAGGTTTTGCAATTGGAATGAGTACAATTTAAATCTCTTAACGAGAACCAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGCAGTTAAAACGTCCGTAGTCGAACTTTGGGTTTGGGCTTGTGCCTGGCGTCCTTCATTGGGCGTTTGGGTTGCATGCCTTGCCATGTTGTAGGGGTGCAGTCTTTCGGGGC
12、TGATGATCTCTGCGTATTACCATGAGCAAATCAGAGTGCTCAAAGCAGGCTTTATAGCTTGAATGTTTTAGCATGGAATAATGAAATAAGCCTTAGGTCTTGTTTCGTTGGTTTACTTGACACTGGGGAATGATGAATAGGAACGGTTGGGGGCATTTGTATTTGGCCGCTAGAGGTGAAATTCTTGGATTGGCCGAAGACAAACTACTGCGAAAGCATTTGACCCAGGACGTTTTCATTGATCAGGGACTAAAGTTGAGGGATCGAAGACGATTAGATACCGTCGTAGTCTTAACCACAAACTATGCCGACTAGCGATCGCATGGATACTTTTTTTGTTCTATGCGGCAGCTTAGCGAAAGTAAAGTCTTTGGGTTCTGGGGGGAGTATGGGACGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGAGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCACCAGGTCCAGACATAAGAAGGATTGACAGATTGAAAGCTCTTTCTAGATTTTATGGGTGGTGGTGCA,THE END,
