1、大肠杆菌热击感受态细胞的制备、注意事项和转化大肠杆菌感受态细胞的制备和转化大肠杆菌感受态细胞制备的原理：大肠杆菌自然条件下很难进行转化，其主要原因是转化因子的吸收较为困难。在转化实验中，通常先采用人工的方法制备感受态细胞，代表性的方法之一是Ca 2+ 诱导法。 感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA 的结合和加工等。细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA 分子的受体位点等。Ca 2+ 诱导 DNA 对大肠杆菌细胞的转化：在 0 的 CaCl2 低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀，同时CaCl2 使细胞膜磷脂层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部
2、分核酸酶解离开来，诱导大肠杆菌形成感受态。 Ca2+ 能与加入的 DNA 分子结合，形成抗 DNA 酶（DNase ）的羟基 -磷酸钙复合物， 并黏附在细菌细胞膜的外表面上。当42 热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，并随之出现许多间隙，为DNA 分子提供了进入细胞的通道。一、受体菌的培养从 LB 平板上挑取新活化的 E. coli DH5 单菌落 ,接种于 3-5ml LB 液体培养基中 ,37下振荡培养 12 小时左右 ,直至对数生长后期。 将该菌悬液以 1:100-1:50 的比例接种于 100ml LB液体培养基中 ,37 振荡培养2-3 小时至 OD6000.5
3、左右。（ OD 600值在 0.4到 0.6 之间）二、 感受态细胞的制备( CaCl2法 )1、将培养液转入离心管中,冰上放置 10 分钟 ,然后于 4 下 3000g离心 10分钟。2、 弃去上清 ,用预冷的0.05mol/L的 CaCl2溶液 10ml 轻轻悬浮细胞 ,冰上放置 15-30分钟后 ,4下 3000g 离心 10分钟。3、弃去上清 ,加入 4ml 预冷含 15% 甘油的 0.05mol/L 的 CaCl2 溶液 ,轻轻悬浮细胞 ,冰上放置几分钟 , 即成感受态细胞悬液。4、 感受态细胞分装成200l的小份 ,贮存于 -80 可保存半年。大肠杆菌感受态过程中的注意事项：1、细
4、菌的生长状态：不要用经过多次转接或储于4的培养菌，最好从-80 甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。 细胞生长密度以刚进入对数生长期时为宜， 可通过监测培养液的 OD600 来控制。DH5 菌株的 OD600 为 0.5 时，细胞密度在 5107 个/mL左右，这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。2、所有操作均应在无菌条件和冰上进行；实验操作时要格外小心，悬浮细胞时要轻柔，以免造成菌体破裂，影响转化。3、经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加，24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）；大肠杆菌热击
5、感受态细胞的制备、注意事项和转化4、化合物及无机离子的影响：在 Ca2+ 的基础上联合其他二价金属离子（如 Mn2+DMSO 或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000倍）；或Co2+ ）、5、所使用的器皿必须干净。少量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率；6、所用器具的洁净程度。这一点非常重要，是所有与感受态有关的方法与文章上必讲的，毋庸置疑。7、培养基的装量。培养基的装量是很重要的，这关系到菌体生长过程中的能量代谢问题，是有氧还是无氧生长。 厌氧生长出来的菌体是做不出效率高的感受态的。 建议装量不要高于此值：培养基体积 /三角瓶容量 =100ml/50
6、0ml ， 50ml/250ml 。8、培养基的 pH 值。这里讲的 pH 值并非单指配制或灭菌后的pH 值，而且还包括整个摇瓶结束后的 pH 值。一般来说，接种前的pH 值在 6.8-7.2 。等菌摇好后，可以测一下pH 值，不要低于 6.0 ，最好在 6.5 以上。这表示菌体的代谢为有氧代谢，生长状态良好， 按要求做，肯定效率不低。9、培养后的 OD 值。其实这是一个非常重要的参数，只是当OD 值大到一定的程度后，菌体要保持对数生长已经不太可能，因此很多指导方法上强调OD 不得大于 0.6 、 0.8等等。同时， OD 值大时菌体总量大，感受态绝对数量要大一点。因此需要在OD 值的两方面影
7、响中找一个平衡点。10 、培养基中的各种离子。经验证明，当培养基中存在一定量的Mg2+ 离子时，该方法制得的感受态要相对较高。在制备普通感受态时，使用20mM MgCl2做为培养基的添加物，在感受态收获之前20-30 分钟加入，会收到很好的效果。11 、培养温度。文献及经验告诉我们，较低的温度培养有利于感受态的形成，这样可以获得较高的感受态， 但太低又不实用， 因而产生了 Inoue 的高效感受态制备方法， 它实际是利用了所有有利于感受态的文献而得出的一个非常理想方法。12 、此外文献报道，在保存感受态时， DMSO 要比甘油的效果要好，它会使感受态的效率增加。13 、液氮速冻也会使感受态的效
8、率提高，因此推荐用液氮速冻感受态，然后保存于超低温冰箱内。三、转化1、从 -80冰箱中取2、 加入质粒DNA200l感受态细胞悬液溶液 (含量不超过50ng,室温下使其解冻 ,解冻后立即置冰上。体积不超过 10l),轻轻摇匀 ,冰上放置30 分钟后。3、 42 水浴中热击90 秒或 37水浴 5 分钟 ,热击后迅速置于冰上冷却4、向管中加入1ml LB 液体培养基 (无抗性 LB), 混匀后 37振荡培养3-5 分钟。1 小时 ,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因。5、将上述菌液摇匀后取100l 涂布于含抗性 （ Kana 或者 Amp ）的筛选平板上,正面向大肠杆菌热击感
9、受态细胞的制备、注意事项和转化上放置半小时 , 待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37 培养 16-24 小时。同时做两个对照:对照组 1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA 溶液 ,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB 平板上应没有菌落出现。对照组 2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA 溶液 ,但涂板时只取5l 菌液涂布于不含抗生素的 LB 平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。四、计算转化率统计每个培养皿中的菌落数。转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：转化子总数菌落数稀释倍数 转化反应原液总体积涂板菌液体积转化频率（转化子数每mg 质粒 DNA ）转化子总数质粒DNA 加入量 (mg)感受态细胞总数对照组菌落数稀释倍数 菌液总体积涂板菌液体积感受态细胞转化效率转化子总数感受态细胞总数注意 本实验方法也适用于其它E.coli 受体菌株的不同的质粒DNA 的转化。但它们的转化效率并不一定一样。有的转化效率高，需将转化液进行多梯度稀释涂板才能得到单菌落平板 ,而有的转化效率低,涂板时必须将菌液浓缩(如离心 ),才能较准确的计算转化率。
