1、大肠杆菌感受态细胞的制备原理、步骤以及重组质粒转化一、 目的 1.了解感受态细胞生理特性及制备条件，掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。 2.掌握质粒 DNA 转化大肠杆菌的方法，了解转化的条件和利用半乳糖苷酶基因插入失活选择重组质粒 DNA 的原理。 二、原理 （一）大肠杆菌感受态细胞制备的原理 所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源 DNA 而不将其降解的生理状态。感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体 DNA 的结合和加工等。细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的 DNA 分子的受体位点等
2、。本实验为了把外源 DNA（重组质粒）引入大肠杆菌，就必须先制备能吸收外来 DNA 分子 的感受态细胞。在细菌中，能发生感受态细胞是占极少数。而且，细菌的感受态是在短暂时间内发生。 目前对感受态细胞能接受外来 DNA 分子的本质看法不一。主要有两种假说： 1、局部原生质体化假说细胞表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使 DNA 分子能通过质膜进细胞。证据有： （1）发芽的芽孢杆菌容易转化； （2）大肠杆菌的原生质体不能被噬菌体感染，却能受噬菌体 DNA 转化； （3）适量的溶菌酶能提高转化率。 2、酶受体假说感受态细胞的表面形成一种能接受 DNA 的酶 位点，使 DNA
3、 分子能进入细胞。证据是：（1）蛋白质合成的抑制剂如氯霉素，可以抑制转化作用； （2）细胞分裂过程中，一直有局部原生质化，但感受态只在生长对数期的中早期出现； （3）分离到感受态因子，能使非感受态细胞转变为感受细胞。 目前对感受态细胞的转化理论尚未有统一结论，但是许多实验室一直进行探索，试图从实验中获得明确回答。有人根据 pBR322 质粒 DNA 对 E coli K12X1776 菌株的转化结果，认为： 近来，在许多研究室都发现 CaCl2 对受体菌处理，可提高转化效率几十倍，通常把细胞悬浮在pH6.0 的 100mmol/L CaCl2 中，在冰浴条件下，放置过夜，转化率转高，但一过 2
4、4 小时，转化率测恢复为原来的水平。 （二）重组 DNA 的转化原理 我们已经制备好大肠杆菌感受态细胞，接下的实验是把重组的 DNA 引入受体细胞，使受体菌具有新的遗传特性，并从中选出转化子。作为受体的大肠杆菌 C600 或 DH5，必须不同外来DNA 分子发生遗传重组，通常是 rec 基因缺陷型的突变体，同时它们必须是限制系统缺陷或限制与修饰系统均缺陷的菌株。这样外来的 DNA 分子不会受其限制酶的降解。保持外来 DNA 分子在受体细胞中的稳定性。制备的大肠杆菌细胞就具有这三种缺陷（rk - mk- rec- ）同时此受体细胞还是氨苄青霉素敏感（Ap）。 在体外构建好的重组分子上具有分解氨苄
5、青霉素（Ap）基因存在，当它导入受体细胞后，就赋于这些受体细胞新的特性，即 Ap 抗性。同时载体质粒上具有乳糖操纵的 一半乳糖苷酶基因(lacZ)，我们可以利用外源基因插入载体 一半乳糖苷酶基因(lacZ)，使其失去 一半乳糖苷酶活性的原理来选择新构建的重组子。 因 pUC18 带有 Ampr 基因而外源片段上不带该基因,故转化受体菌后只有带有 pUC18 DNA的转化子才能在含有 Amp 的 LB 平板上存活下来;而只带有自身环化的外源片段的转化子则不能存活。此为初步的抗性筛选。 pUC18 上带有 -半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和 -半乳糖苷酶 N 端 146 个氨基酸的编码序列。
6、这个编码区中插入了一个多克隆位点,但并没有破坏 lacZ 的阅读框架,不影响其正常功能。E.coli DH5 菌株带有 -半乳糖苷酶 C 端部分序列的编码信息。在各自独立的情况下,pUC18 和 DH5 编码的 -半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。但在 pUC18 和 DH5 融为一体时可形成具有酶活性的蛋白质。这种 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的 -半乳糖苷酸阴性突变体之间实现互补的现象叫 -互补。 由 -互补产生的 Lac 细菌较易识别，它在生色底物 X-gal(5-溴-4 氯-3-吲哚-D -半乳糖苷)存在下被 IPTG(异丙基硫代-D -半乳糖苷)诱
7、导形成蓝色菌落。当外源片段 TGF插入到pUC18 质粒的多克隆位点上后会导致读码框架改变 ,表达蛋白失活,产生的氨基酸片段失去 -互补能力,因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。由此可将重组质粒与自身环化的载体 DNA 分开。此为 -互补现象筛选。 本实验是把外来重组分子和感受态细胞在低温下混合，使其进入受体细胞。DNA 分子转化的原理较复杂： 1、吸附完整的双链 DNA 分子吸附在受体菌表面。 2、转入双链 DNA 分子解链，单链 DNA 分子进入受体菌，另一链降解。 3、自稳外源质粒 DNA 分子在细胞内又复制成双链环状 DNA。 4、表达供体基因随同复制
8、子同时复制，并被转录和翻译 5.无菌条件下将上述 1 毫升菌液倒入 1.5 毫升 EP 离心管中（离心管应带盖并高压灭菌过） ，每组 2 支。 6、带菌液的离心管置于冰上 10 分钟，冷却菌液，平衡好，置于台式低速离心机上，3500r/min 离心 5 分钟。 7、无菌条件下，倒去上清 LB，倒斜离心管，让 LB 流干，留下沉淀菌体，加入预冷的100mmol/L CaCl2 溶液 600 微升，用微量取样器轻轻吸冲底部沉淀菌体，使其悬浮后，把2 支管转为 1 支，摇匀后于冰浴中放置 30 分钟。 8、重新将 CaCl2 菌悬浮液置于台式低速离心机上，3500r/min 离心 10 分钟，小心侧
9、倒掉上清 CaCl2 ，留沉淀菌体。 9、再把菌体悬浮在 200 微升 100mmol/L CaCl2 的溶液中，置于冰上作为转化的受体菌液。此制备的感受态细胞应在此步后 1 小时至 24 小时内使用，效率比较高。 10.在事先制备好的含 50g/ml Amp 的 LB 平板表面加 40ml X-gal 储液和 4lIPTG 储液,用无菌玻棒将溶液涂匀,置于 37下放置 3-4 小时,使培养基表面的液体完全被吸收，备用。 （二）重组 DNA 转化 1.取 0.2ml 大肠杆菌感受态细胞，在无菌条件下，加入到连接液的 Eppendorf 管，混匀，置冰浴中 30 分钟。 2.冰浴后，将正在转化反
10、应的细胞悬浮液加入已调好 42的的恒温水浴槽内，保温 2 分种。 3.热冲击处理后的细胞易死亡，应迅速倒入 LB 培养液 1 毫升， （无抗菌素 LB 液，有助于基因表达）马上置 37水浴 1 小时，每 10 分钟翻转 1 次。 4.用移液器取 0.1 毫升的转化菌液直接涂布含 50g/ml Amp、40ml X-gal 储液和 4lIPTG 储液 LB 固体平皿上，共涂布三个培养皿。 5.用移液器取未经转化的受体大肠杆菌感受态菌液 0.1 毫升直接涂布于含50g/mlAmp、40ml X-gal 储液和 4lIPTG 储液 LB 固体平皿上，作为受体菌对照。 6.将第 14、15 步涂布培养皿先放室温 15 分钟左右，使涂布上的菌液干燥不会流动。然后倒置放于恒温箱中 37培养过夜。 7.第二天取出培养皿，观察对照平皿和转化平皿菌落情况。对照平皿因受体菌对 Amp 敏感，故不能在含 Amp 的培养基上生长。转化平皿是否有兰色和白色菌落生成？如果长出兰色菌落，说明自连的载体 pUC18 质粒 已转入受体菌，但目的基因没有接入载体。如果长出白色菌落，说明目的基因已接入载体，重组质粒的转化子因此丧失了 -半乳糖苷酶活性,在 x-gal 和 ITPG 存在的生色诱导培养基上只能形成白色菌落。 五、结果和讨论 比较对照平皿和转化平皿，讨论转化成败原因.
