1、大肠杆菌感受态的制备、 重组DNA的转化和抗药性筛选,中山医学院,朱文博,大肠杆菌感受态的制备及重组体转化 （p93）,1 感受态(competent),宿主细胞处于容易吸收外源性DNA的状态成为感受态； 处于感受态的细胞称为感受态细胞.,1.1 制备感受态细胞的原理,正常细胞都有细胞膜（细菌还有细胞壁）作屏障，对外源分子选择性接受。在实验中通过一定的理化条件使细胞膜通透性增大，处于感受态。,1、CaCl2转化程序法：传统方法,转化效率能达到5106-2107转化子/g质粒DNA,简单、快速、重复性好、菌株适用范围广。2、电穿孔转化法：通过高强度的电场作用，瞬时提高细胞膜的通透性，从而吸收周围
2、介质中的外源分子；3、脂质体(liposome)法：阳离子脂质体能将DNA分子包裹入内，形成DNA一脂复合体，将DNA传递进入细胞；4、胞核的显微注射法(microinjection)；5、磷酸钙介导的转染：将氯化钙，RNA(或DNA)和磷酸缓冲液混合，沉淀形成极小的不溶的磷酸钙颗粒，粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞 的细胞质 ；6、聚乙二醇介导的原生质体转化法：指通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。,1.2 制备感受态细胞和转化的常用方法,1. 一般受体菌对重组DNA分子的摄取能力很低，难以转化成功。当细菌处于冰冷（0）0
3、.05-0.1M的 CaCl2低渗溶液中，菌体的细胞膨胀成球形，细胞膜的通透性增加，对DNA的摄取能力增强，转化效率提高（感受态细菌）。2.在转化体系中形成DNA-抗DNase的羟基-磷酸钙复合物能粘附于细菌表面，经过42短时间热休克（heat shock）处理，细胞膜的液晶结构发生扰动，出现间隙促进感受态细胞吸收DNA复合物。3.在丰富培养基上生长1小时后，球状细胞复原并分裂增殖，重组子中的基因在转化细菌中得到表达，在选择性培养(selective culture)平板上即可筛选出所需的转化子。,2 CaCl2法制备感受态细胞和转化的原理,0.1mol/LCaCl2,0,感受态细胞,受体细胞
4、,细胞膜特性改变,42 短时间热休克,3 实验步骤,制备感受态细菌,吸收复合物,形成复合物,细胞复原增殖,用无菌弯头玻璃铺菌器将200 l菌液铺于含Amp的琼脂平板表面 室温放置10 min，使液体被吸收倒置平皿，370C培养，12小时可见菌落生长,重组体克隆的筛选与鉴定,由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法得到含有重组DNA的阳性克隆。,不含质粒的细菌,不生长,含质粒的白色菌落,含pUC119、pUC119-u6质粒的细菌,混合有氨苄青霉素的平板,混合有氨苄青霉素的平板,基因克隆,基因克隆示意图,分、切,接,转,筛,基因克隆基本步骤,（1）分（分离目的基因）：
5、从生物体复杂的基因组中分离出所需要的DNA片段，即目的基因 （2）切（切割目的基因和基因载体）：用限制性内切核酸酶切割目的基因和基因载体，以利于将两者连接形成重组体。 （3）接（连接目的基因和基因载体）：在体外将目的基因连接到能够自我复制的载体DNA分子上，形成重组DNA（重组体）。,（4）转（转化至宿主细胞）：将重组体引入（转化或转染）到宿主细胞（受体细胞）中，转化后的细胞进行扩增繁殖，获得大量的细胞繁殖群体。 （5）筛（筛选阳性细胞克隆）：从大量的细胞繁殖群体中筛选出转化成功（带有重组体）的阳性细胞克隆。,1 目的基因的获取,1.1 化学合成法：已知序列 1.2 基因组DNA文库： 将某种
6、生物的基因组DNA切割成一定大小的片段，并与合适的载体重组后导入宿主细胞，进行克隆。这些存在于所有重组体内的基因组DNA片段的集合，即基因组文库，它包含了该生物的所有基因。用于研究基因在基因组中的情况。 1.3 cDNA文库：以组织细胞中的mRNA为模板，经反转录等反应合成双链cDNA ，各cDNA分子分别插入载体形成重组子，再导入宿主细胞克隆扩增。这些在重组体内的cDNA的集合即cDNA文库。仅包含正在表达的基因，总量少，易筛选。 1.4 聚合酶链反应(PCR):广泛采用,2 克隆载体的选择和构建,基因工程的载体应具有一些基本的性质： 1）在宿主细胞中有独立的复制和表达的能力 2）分子量尽可
7、能小 3）载体分子中最好具有两个以上的容易检测的遗传标记 4）载体本身最好具有尽可能多的限制酶单一切点。 DNA克隆常用的载体有：质粒载体(plasmid)，噬菌体载体(phage)、柯斯质粒载体(cosimid)、单链DNA噬菌体载体(ssDNA phage)、噬粒载体(phagemid)及酵母人工染色体(YAC)等。,3 外源基因与载体的连接,粘性末端连接：平头末端连接：,同聚寡核苷酸末端连接人工接头分子连接：,四 重组DNA导入宿主细胞,转化(transformation)或转染(transfection)：通过特殊的处理方法将外源遗传物质(如质粒DNA等)导入原核或真核细胞，引起遗传性
8、状变化的现象。 感染(infection)：病毒类侵染宿主菌的过程称为感染，一般转导的效率比转化高。,五 重组体的筛选,(1)直接筛选：抗药性标志选择标志补救:蓝白斑筛选(互补原理筛选重组体)分子杂交：广泛用于筛选含有特异DNA顺序的克隆。方法是将菌落或噬菌斑“印迹”到硝酸纤维膜等支持物上，变性后固定在原位，然后与标记的核酸探针进行杂交。阳性点的位置就是所需要的克隆。 (2)免疫学方法：如果重组克隆能在宿主菌中表达，就可以用特异的蛋白质抗体为探针，进行原位杂交，选择特异的克隆。,(直接选择法) 抗药性标记选择,(插入失活法) 抗药性标记选择, 互补的检测,U6,未转化的菌不具有抗性，不生长； 转化了空载体，即未重组质粒的菌，长成蓝色菌落； 转化了重组质粒的菌，即目的重组菌，长成白色菌落。,。,原位菌落 杂交,放射性抗体检测法,Thank you!,
