1、阿维链霉菌基因重组菌株的选育食品科学， 2011， 硕士【摘要】 随着人们生活水平的提高,国际上和国内的消费者对于化学农药造成的直接或间接的危害越来越重视。阿维菌素作为生物农药的一种,是迄今为止人类发现的最有效的杀螨杀虫抗生素。阿维菌素的的发酵是一个好氧的生物过程。传统工业的微生物发酵使用深层高密度的发酵罐,溶氧常常成为发酵产品产量的重要限制性因素。本研究通过将含有透明颤菌血红蛋白基因的质粒转化到阿维链霉菌中,从而改善阿维链霉菌的供氧条件,促进阿维链霉菌的生长以及提高阿维菌素的产量。本文重点考察了影响阿维链霉菌原生质体的制备和再生的因素。首先,通过对阿维链霉菌发酵过程中定点取样,用菌体干重法测
2、得了阿维链霉菌的生长曲线。以此确定原生质体制备的菌丝体最佳培养时间为 60 h。在培养基中加入浓度为 0.25 g/ml甘氨酸。溶菌酶的浓度为 2 %,在 34恒温条件下酶解 30 min。在此条件下形成的原生质体的量最大为 6.4108个/ml。采用双层平板涂布法,将制备的原生质体涂布于加有 0.2 %的 MgCl26H2O 缓冲剂的再生培养基上。涂布的密度为每个平板不多于 1000 个原生质体。在此条件下得到. 更多还原【Abstract】 With increasing of the consumers of the international market and domestic t
3、o the quality of agricultural products, people attach great importance to hazards from the agricultural pollution by tocic chemicals.As a kind of biological pesticides, avermectin is the most effective antibiotics to insecticidal and acaricidal so far. The process of fermentation of streptomyces whi
4、ch can product the avermectin is an aerobic process. The traditional fermentation in industry uses the high-density and deepl. 更多还原 【关键词】 阿维菌素； 透明颤菌血红蛋白； 原生质体制备及再生；转化； 溶氧； 【Key words】 avermectin； Vitreoscilla hemoglobin； protoplast formation and regeneration； conversion； dissolved oxygen； 摘要 4-5 Abs
5、tract 5 第 1 章 绪论 9-17 1.1 概述 9-12 1.2 阿维菌素的结构及其理化性质 12-14 1.3 阿维链霉菌及伊维菌素的作用机理 14-15 1.4 阿维菌素的研究进展 15 1.5 阿维菌素的分离提取与检测 15-16 1.6 本课题的研究目的与方法 16-17 第 2 章 阿维链霉菌原生质体的制备 17-27 2.1 实验材料 17-19 2.1.1 实验仪器 17 2.1.2 菌种 17 2.1.3 培养基 17-18 2.1.4 主要溶液的配制 18-19 2.1.5 主要试剂 19 2.2 实验方法 19-20 2.2.1 菌种的活化 19 2.2.2 担孢
6、子悬液的制备 19 2.2.3 菌丝体的培养 19-20 2.2.4 原生质体的制备 20 2.3 实验结果与讨论 20-24 2.3.1 不同菌龄对原生质体制备的影响 20-22 2.3.2 甘氨酸浓度对原生质体制备的影响 22 2.3.3 酶的浓度对原生质体制备的影响 22-23 2.3.4 酶解时间对原生质体制备的影响 23-24 2.3.5 酶解温度对原生质体制备的影响 24 2.4 本章小结 24-27 第 3 章 阿维链霉菌原生质体的再生 27-35 3.1 实验材料 27-29 3.1.1 实验仪器 27 3.1.2 实验菌种 27 3.1.3 培养基 27-29 3.2 实验方
7、法 29 3.2.1 菌丝体的培养 29 3.2.2 原生质体的制备 29 3.2.3 原生质体的再生 29 3.3 实验结果与讨论 29-33 3.3.1 再生培养基对原生质体再生的影响 29-31 3.3.2 酶解时间对原生质体再生的影响 31 3.3.3 再生培养方法对原生质体再生的影响 31-32 3.3.4 原生质体放置条件及时间对原生质体再生的影响 32 3.3.5 平板涂布密度对原生质体再生的影响 32-33 3.4 本章小结 33-35 第 4 章 透明颤菌血红蛋白基因的转化 35-47 4.1 实验材料 35-38 4.1.1 实验仪器 35-36 4.1.2 实验菌种 36
8、 4.1.3 培养基 36-37 4.1.4 主要试剂 37 4.1.5 缓冲液 37-38 4.1.6 其他试剂 38 4.2 实验方法 38-42 4.2.1 大肠杆菌 DH-5a 的收获和裂解 38 4.2.2 大肠杆菌 DH-5a，pUC18/vgb 质粒的提取 38-39 4.2.3 pUC18/vgb 质粒的纯化 39 4.2.4 酶切质粒 DNA 及目的基因 39 4.2.5 凝胶板的制备 39 4.2.6 DNA 片段电泳及燃烧我观察 39-40 4.2.7 质粒 DNA 凝胶片段的回收 40 4.2.8 变铅青链霉菌的质粒提取 40-41 4.2.9 穿梭质粒载体与目的基因的连接 41 4.2.10 原生质体的转化 41 4.2.11 Vhb 基因 PCR 反应 41 4.2.12 超声波提取阿维菌素 41-42 4.3 实验结果与讨论 42-45 4.3.1 大肠杆菌 DH-5a 中 vgb 基因的鉴定 42 4.3.2 大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒的构建 42-43 4.3.3 硫链丝菌素的最低添加浓度 43-44 4.3.4 透明颤菌血红蛋白对阿维菌素产量的影响 44-45 4.4 本章小结 45-47 结论 47-49 参考文献
