第六章 微生物生长及其控制1.ppt

1、第六章 微生物生长及其控制,主要内容：,第一节 测定微生物生长的方法 第二节 微生物的生长规律 第三节 影响微生物生长的主要因素 第四节 微生物培养 第五节 微生物生长的控制,微生物生长的几个概念,个体生长群体生长,个体数量的增加或细胞群体总质量的增加 。,繁殖（reproduction)：微生物个体数目的增加。,群体生长=个体生长+繁殖,微生物个体细胞物质、结构组分和体积有规律地、不可逆地增加。,第一节 微生物生长的测量,细胞数目（计繁殖数）的测定 细胞物质(biomass，生长量)的测定,第六章 微生物生长及其控制,一、细胞数目的测定,显微镜直接计数法 菌落计数法 比浊法 库尔特电子计数器

2、计数法 流动式细胞光度计,第一节 微生物生长的测量,显微镜直接计数法,每毫升原液所含菌体数（个）=每小方格平均菌体数400101000稀释倍数,不足： 不能区分死细胞和活细胞，应用范围较窄 一些小的细胞在显微镜下很难看到； 样品中菌液浓度不能低于106个/mL 不能用于菌丝体或呈链状而不分散的微生物测定。,第一节 微生物生长的测量,菌落计数法（活菌计数法）,平板菌落计数法 载片培养计数法 微孔滤膜法,第一节 微生物生长的测量-细胞数量的测定,平板菌落计数法,灵敏度高 可以区分死活细胞 应用广,优点,不足 测定的结果误差也较大。 操作也比较烦琐 需要的时间较长,第一节 微生物生长的测量,第一节

3、微生物生长的测量-细胞数量的测定,比浊法,原理：是在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比，即与光吸收值(OD)成正比，菌数越多， OD越大。因此，借助于分光光度计，在一定波长下测定菌悬液的OD ，就可反应出菌液的浓度。,特点： 快速、简便；但易受干扰。,细胞数目或干重与培养液浊度的关系,第一节 微生物生长的测量-细胞数量的测定,库尔特电子计数器计数法,第一节 微生物生长的测量-细胞数量的测定,流动式细胞光度计,快速细胞计数，其计数的效率可达3000个/秒 分析 分检,第一节 微生物生长的测量-细胞数量的测定,二、细胞物质的测定,重量法 细胞沉降体积法 细胞量的间接估计,第一节 微生物生

4、长的测量,重量法,第一节 微生物生长的测量-细胞物质的测定,将一定量的菌液中的菌体通过离心或过滤分离出来,然后烘干至恒重(干燥温度可采用105、100或80)、称重。一般干重为湿重的10%20%，而一个细菌细胞一般重约10-1210-13g。 该法适合菌浓较高的样品。 举例：大肠杆菌一个细胞一般重约10121013g，液体培养物中细胞浓度达到2109个/ml时，100ml培养物可得1090mg干重的细胞。,细胞量的间接估计,测含氮量 蛋白质是细胞的主要物质，含量稳定，而氮是蛋白质的主要成分，通过测含氮量就可推知微生物的浓度。 一般细菌含氮量为干重的12.5%，酵母菌为7.5%，霉菌为6.0%，

5、根据一定体积培养液中的含氮量再乘以6.25，就可测得粗蛋白的含量。 其他方法 含碳、磷、DNA、RNA、耗氧量、消耗底物量、产二氧化碳、产酸、产热、粘度、ATP等，都可用于生长量的测定。,第二节 微生物的生长规律,一、微生物的个体生长和同步生长 二、微生物的群体生长,一、微生物的个体生长和同步生长,个体生长微生物个体细胞物质、结构组分和体积有规律地、不可逆地增加。 个体生长研究方法： 电子显微镜超薄切片 同步培养技术（synchronous culture）：设法使群体中的所有细胞尽量都处于同样的细胞生长和分裂周期中，然后分析此群体的各种生物化学特征，从而了解单个细胞所发生的变化。,同步生长（

6、synchronous growth）,一个细胞群体中各个细胞都在同一时间进行分裂的状态，称为同步生长，进行同步分裂的细胞称为同步细胞。,获得同步生长的方法,环境条件诱导法：变换温度、光线、培养基、加入抑制剂-解除抑制等。造成与正常细胞周期不同的周期变化。 温度开始很低，使其均处在仅活着的状态升高温度 同步生长 抑制生长法： 加入代谢抑制剂，阻遏DNA复制解阻遏同步 机械法选择 收集同样大小的细胞 密度梯度离心选择性滤膜法,一、单细胞无分支微生物的典型生长曲线,生长曲线的制作：将少量单细胞的纯培养，接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中，在适宜条件下培养，每隔一定时间取样，测量活细胞数目。以培养时

7、间为横坐标，以细胞增长数目的对数为纵坐标，绘制所得的曲线。,微生物的群体生长,典型的生长曲线,延滞期,对数期,稳定期,衰亡期,时期的划分：按照生长速率常数（growth race constant，每小时分裂次数）不同,生长曲线代表了微生物在新的环境中从开始生长、分裂直至死亡的整个动态变化过程。,其它名称：停滞期、调整期、适应期 现象：活菌数没增加，曲线平行于横轴。生长速率常数= 0 个体特点： 细胞形态变大或增长 细胞内RNA特别是rRNA含量增高，原生质嗜碱性增强 合成代谢活跃（核糖体、酶类、ATP合成加快），易产生诱导酶 对外界不良条件敏感，（如氯化钠浓度、温度、抗生素等化学药物）,1.

8、延滞期（lag phase）,原因：适应新的环境条件，合成新的酶，积累必要的中间产物,分裂迟缓、代谢活跃,菌种 ：繁殖速度较快的菌种的延迟期一般较短； 接种物菌龄 ：用对数生长期的菌种接种时，其延迟期较短，甚至检查不到延迟期； 接种量：一般来说，接种量增大可缩短甚至消除延迟期； 培养基成分： 在营养成分丰富的天然培养基上生长的延滞期比在合成培养基上生长时短； 接种后培养基成分有较大变化时，会使延滞期加长,影响延迟期长短的因素：,认识延迟期的特点及形成原因 对实践的指导意义：,在发酵工业上需设法尽量缩短延迟期； 采取的缩短lag phase 的措施有： 增加接种量； （群体优势-适应性增强） 采

9、用对数生长期的健壮菌种； 调整培养基的成分，在种子基中加入发酵培养基的某些成分。 选用繁殖快的菌种 在食品工业上，尽量在此期进行消毒或灭菌,(2) 指数期（exponential phage） ，又叫对数期（logarithmic phase）,现象：细胞数目以几何级数增加，其对数与时间呈直线关系。 细胞特点： 酶系活跃，代谢旺盛； 细胞进行平衡生长，菌体内各种成分最为均匀；,典型的细菌生长曲线,代时和倍增时间,代时： 细胞繁殖一代所需要的时间。 倍增时间（G） ：细胞数目或细胞物质增加一倍所需要的时间。 生长速率常数R:每小时分裂的次数,Lg X2 = nlg2 +lgx1,n= =3.32

10、2(lg X2- lg X1),lg X2- lg X1,lg2,指数生长可以用下式表示： X2 = x12n,式中：x1 为起始时细胞数目，x2为指数生长某个时刻 t 时的细胞数目，n 为世代数,例如：一培养液中微生物数目由开始的12，000（ x1 ），经4h （ t ）后增加到49，000，000（x2）， 这样， n (lg4.9107lg1.2104）0.30112,借助于 n 和 t ，还可以计算出不同培养条件下的代时G，G t / n 在本例中， G 460 / 12 20min 该种微生物的代时为20分钟。在4小时内共繁殖了12代。,生长速率常数R：,代时能够反应细菌的生长速率

11、，代时短，生长速率快，代时长，生长速率慢。在很多微生物学研究中常常要了解微生物的代时。 代时在不同种微生物中的变化很大，多数微生物的代时为13h,然而有些快速生长的微生物的代时还不到10min,而另一些微生物的代时却可长达几小时或几天；另外，同一种微生物，在不同的生长条件下其代时的长短也不同；但是，在一定条件下，每一种微生物的代时是恒定的，因此它是微生物菌种的一个重要特征。,微生物生长的重要参数代时,影响微生物代时的因素,菌种 营养成分 营养物浓度 培养温度,一些细菌的代时,菌名 培养基 培养温度 代时min E. coli（大肠杆菌） 肉汤 37 17 E. coli 牛奶 37 12.5

12、Enterobacter aerogenes（产气肠细菌） 肉汤或牛奶 37 1618 E. aerogenes 组合 37 2944 B. Cereus（蜡状芽孢杆菌） 肉汤 30 18 B. thermophilus（嗜热芽孢杆菌） 肉汤 55 18.3 Lactobacillus acidophilus（嗜酸乳杆菌） 牛奶 37 6687 Streptococcus lactis（乳酸链球菌） 牛奶 37 26 S. lactis 乳糖肉汤 37 48 Salmonella typhi（伤寒沙门氏菌） 肉汤 37 23.5 Azotobacter chroococcum（褐球固氮菌） 葡

13、萄糖 25 34446 Mycobacterium tuberculosis（结核分枝杆菌）组合 37 79293 Nitrobacter agilis（活跃硝化杆菌） 组合 27 1200,不同温度下的代时,温度对微生物的代时有明显影响：E. Coli 在不同温度下的代时 温度（） 代时（分） 温度（） 代时（分） 10 860 35 22 15 120 37 17 20 90 40 17.5 25 40 45 20 30 29 47.5 77,营养物质的浓度对生长速度的影响,细胞数或菌体量,由于此时期的菌种比较健壮，增殖噬菌体的最适菌龄；生产上用作接种的最佳菌龄； 发酵工业上尽量延长该期，

14、以达到较高的菌体密度 食品工业上尽量使有害微生物不能进入此期 是生理代谢及遗传研究或进行染色、形态观察等的良好材料。,认识对数期的特点对生产实际的指导意义,3.稳定期（stationary phase） ，又称：恒定期或最高生长期,（1）特点： 新生的细胞数目与死亡的细胞数目相等，总菌数达到最大值，活菌数保持恒定。 细胞转向衰老，生长不平衡。 代谢产物逐渐积累。,典型的细菌生长曲线,（2）出现的原因：营养物尤其是生长限制因子的耗尽营养物的比例失调，如碳氮比不合适;有害代谢废物的积累（酸、醇、毒素等）物化条件（pH、氧化还原势等）不合适;,指导意义,发酵生产形成的重要时期（抗生素、氨基酸等），生

15、产上应尽量延长此期，提高产量，措施如下： 补充营养物质（补料） 调pH 调整温度 指导收获：生产氨基酸、核苷酸或收获菌体时可在稳定期收获。,4. 死亡期 （decline phase） ， 又叫衰亡期,（1）特点： 细胞的死亡率将逐渐增加，群体中活的细胞数目急剧下降； 细胞内颗粒更明显，细胞出现多形态、畸形或衰退形，芽孢开始释放。 细胞裂解或自溶，释放出一些代谢产物。,典型的细菌生长曲线,（2）产生原因： 生长条件的进一步恶化，使细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，继而导致菌体的死亡,4、 二次生长,二、丝状微生物的群体生长,丝状微生物的纯培养采用孢子接种，在液体培养基中震荡培养或深层通气加搅拌

16、培养，菌丝体通过断裂繁殖不形成产孢结构。可以用菌丝干重作为衡量生长的指标，即以时间为横坐标，以菌丝干重为纵坐标，绘制生长曲线。,可分为三个阶段： 1、生长停滞期 2、迅速生长期 3、衰退期,1、生长停滞期: 造成生长停滞的原因一是孢子萌发前真正的停滞状态，另一种是生长已经开始，但还无法测定。 2、迅速生长期:菌丝体干重迅速增加，其立方根与时间呈直线关系，菌丝干重不以几何级数增加，没有对数生长期。生长主要表现在菌丝尖端的伸长和出现分支、断裂等，此时期的菌体呼吸强度达到高峰，有的开始积累代谢产物。 3、衰退期:菌丝体干重下降，到一定时期不再变化。大多数次级代谢产物在此期合成，大多数细胞都出现大的空

17、泡。有些菌丝体还会发生自溶菌丝体，这与菌种和培养条件有关。,二、丝状微生物的群体生长,三、连续培养（continuous culture）,分批培养（batch culture） ：将微生物置于一定容积的定量的培养基中培养，培养基一次性加入。不再补充和更换，最后一次性收获。,连续培养（continuous culture） ：在微生物培养的过程中，不断地供给新鲜的营养物质，同时排除含菌体及代谢产物的发酵液，让培养的微生物长时间地处于对数生长期，以利于微生物的增殖速度和代谢活性处于某种稳定状态。,三、连续培养（ Continuous culture ）,最简单的连续培养装置： 培养室 无菌培养基

18、容器 流速控制系统（流入、流出） 通气、搅拌系统,the chemostat,（恒化培养器）,原理：当微生物在单批培养方式下生长达到对数期后期时，一方面以一定的速度流进新鲜培养基并搅拌，另一方面以溢流方式流出培养液，使培养物达到动态平衡，其中的微生物就能长期保持对数期的平衡生长状态和稳定的生长速率。,连续培养原理,连续 培养器,按控制方式分按培养器的级数分 按细胞状态分 按用途分,内控制（控制菌体密度）：恒浊器 外控制（控制培养液流速、以控制生长速率）：恒化器,单级连续培养器 多级连续培养器,一般连续培养器 固定化细胞连续培养器,实验室科研用：连续培养器 发酵生产用：连续发酵罐,连续培养器,连

19、续培养技术恒化连续培养,概念：以恒定流速使营养物质浓度恒定而保持细菌生长速率恒定的方法。 原理：通过控制某一种营养物浓度（如碳、氮源、生长因子等） ，使其始终成为生长限制因子，而达到控制培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率条件下进行生长繁殖。 特点：菌体生长速率恒定，菌体均一、密度稳定，产量低于最高菌体产量。 应用范围：实验室科学研究,概念：通过调节培养基流速，使培养液浊度保持恒定的连续培养方法。 原理：通过调节新鲜培养基流入的速度和培养物流出的速度来维持菌浓度不变,即浊度不变。主要采用恒浊器，当浊度高时，使新鲜培养基的流速加快，浊度降低，则减慢培养基的流速。 特点：基质过量

20、，微生物始终以最高速率进行生长，并可在允许范围内控制不同的菌体密度；但工艺复杂，烦琐。,连续培养技术恒浊培养,使用范围：用于生产大量菌体、生产与菌体生长相平行的某些代谢产物，如乳酸、乙醇等。,连续发酵（continuous fermentation）,连续培养在生产上的应用，相对于单批发酵而言。 优点： 高效，简化了操作装料、灭菌、出料、清洗发酵罐等单元操作； 自控：便于利用各种仪表进行自动控制； 产品质量稳定 节约大量动力、人力、水和蒸汽，且使水、汽、电的负荷均衡合理。 缺点：菌种易于退化；易于遭到杂菌污染；营养物利用率低于单批培养。 连续发酵的生产时间受以上因素限制，一般只能维持数月 1年

21、。,四、微生物的高密度培养,高密度培养（high cell-density culture,HCDC):微生物在液体培养时细胞群体超过常规培养10倍以上时的培养技术。 具体方法： 培养基的选择： 补料 提高溶解氧 防止有害代谢产物生成,第三节 环境对微生物生长的影响,适宜的环境条件能促进微生物的生长；在不利的条件下，微生物生长速率降低甚至完全不生长；当环境条件进一步恶化时，微生物细胞死亡和溶解。,影响微生物生长的主要因素 营养物质 水活度 温度 pH 氧气,一、 温度对微生物生长的影响,影响酶的活性 影响细胞膜的流动性 影响物质的溶解度,从微生物整体来看: 生长的温度范围一般在-10 100

22、极端下限为-30 ，极端上限为105300 但对于特定的某一种微生物： 只能在一定温度范围内生长，在这个范围内，每种微生物都有自己的生长温度三基点，即最低、最适、最高生长温度,（一）微生物生长的三个温度基点,根据微生物的最适生长温度的不同，可将微生物划为三个类型：,（二）微生物生长温度类型,低温型微生物（嗜冷微生物） 中温型微生物（嗜温微生物） 高温型微生物（嗜热微生物）,低温型微生物: 最适生长温度在520,主要分布在地球的两极、冷泉、深海、冷冻场所及冷藏食品中。 例：假单孢菌中的某些嗜冷菌在低温下生长，常引起冷藏食品的腐败。 嗜冷微生物在低温下生长的机理，目前还不清楚，据推测有两种原因：

23、它们体内的酶能在低温下有效地催化，在高温下酶活丧失细胞膜中的不饱和脂肪酸含量高，低温下也能保持半流动状态，可以进行物质的传递。,中温型微生物： 最适生长温度为2040 ，大多数微生物属于此类。 室温型主要为腐生或植物寄生，在植物或土壤中。 体温型主要为寄生，在人和动物体内。 高温型微生物： 最适生长温度为50 60 ,主要分布在温泉、堆肥和土壤中。 在高温下能生长的原因：酶蛋以及核糖体有较强的抗热性核酸具有较高的热稳定性（核酸中G+C含量高（tRNA），可提供形成 氢键，增加热稳定性 ）。 细胞膜中饱和脂肪酸含量高，较高温度下能维持正常的液晶状态。,高温微生物的特点: 生长速度快，合成大分子迅

24、速，可及时修复高温对其造成的分子损伤。 耐高温菌具应用优势：在减少能源消耗、减少染菌、缩短发酵周期等方面具重要意义。,菌 名 生长温度 发酵温度 累积产物温度（ ） （ ） （ ） Streptococcus thermophilus 37 47 37 S.lactis 34 40 产细胞：2530产乳酸：30 Streptomyces griseus 37 28 _ Corenybacterium pekinense 32 3335 _ Clostridium acetobutylicum 37 33 _ Penicilium chrysogenum 30 25 20 以青霉素的生产为例：培

25、养165小时采用分段控制温度的方法，其青霉素产量比始终在30 培养提高了14.7%。 分段控制方式：05小时，30 ；540小时，25 ；40125小时，20 ；125165小时，25 。,不同生理生化过程的最适温度,微生物不同生理活动要求不同温度，所以， 最适生长温度 发酵速度快、积累代谢产物多。,某些微生物的最适生长温度和最适发酵温度,最适生长温度并不一定是最适发酵温度,影响细胞膜所带的电荷从而影响膜的通透性和对营养物质的吸收和代谢产物的排出； 改变培养基中化合物和重要的中间代谢产物的离子化状态，从而影响它们在培养基中的溶解性能和菌体对这些物质的利用； 影响酶蛋白的解离度和电荷情况，改变酶

26、蛋白的结构和功能，进而影响酶的活性。,二、 pH 对微生物生长的影响,二、 pH 对微生物生长的影响,每一种微生物都有一个最适的pH生长范围；不同的微生物生长的最适、最低和最高pH不同 低于或超出最低或最高pH，微生物的生长受抑制 最适生长pH不等于最适发酵pH,不同微生物的生长pH,一些微生物最适生长pH和最适发酵pH,嗜碱微生物：硝化细菌、尿素分解菌、多数放线菌 耐碱微生物：许多链霉菌 中性微生物：绝大多数细菌，一部分真菌 嗜酸微生物：硫杆菌属 耐酸微生物：乳酸杆菌、醋酸杆菌,根据微生物生长的最适pH值， 将微生物分为：,三、氧气对微生物生长的影响,专性好氧菌（strick aerobe)

27、 微好氧菌（microaerophilic bacteria) 耐氧菌(aerotolerant aererobe) 兼性厌氧菌（faculatative anaerobe) 厌氧菌(anaerobe),第三节 环境对微生物生长的影响,专性好氧菌（strict aerobe）,必须在有分子氧的条件下才能生长，有完整的呼吸链，以分子氧作为最终氢受体，细胞含有超氧物歧化酶（SOD，superoxide dismutase）和过氧化氢酶。,在有氧或无氧条件下均能生长，但有氧情况下生长得更好，在有氧时靠呼吸产能，无氧时接发酵或无氧呼吸产能；细胞含有SOD和过氧化氢酶。,微好氧菌（microaeroph

28、ilic bacteria）,只能较低的氧分压下才能正常生长，通过呼吸链并以氧为最终氢受体而产能，,兼性厌氧菌（faculatative anaerobe),耐氧菌（aerotolerant anaerobe）,可在分子氧存在下进行厌氧生活的厌氧菌。生活不需要氧，分子氧也对它无毒害。不具有呼吸链，依靠专性发酵获得能量。,厌氧菌（anaerobe）,分子氧对它有毒害，短期接触空气，也会抑制其生长甚至致死；在空气或含有10%CO2的空气中，在固体培养基表面上不能生长，只有在其深层的无氧或低氧化还原电势的环境下才能生长；生命活动所需能量通过发酵、无氧呼吸、循环光合磷酸化或甲烷发酵提供；细胞内缺乏SO

29、D和细胞色素氧化酶，大多数还缺乏过氧化氢酶。,Can you tell the difference?,氧的毒害机制和微生物解毒机制,氧的毒害形式 超氧负离子（O2-）、过氧化氢(H2O2)、羟基自由基(OH),H2O2 2H2O + O2,catalases,2O2- H2O2H2O + O2,SOD,超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD) 过氧化氢酶（catalase),氧毒害的解除,培养好氧微生物：需震荡或通气，保证充足的氧气。 培养专性厌氧微生物：需排除环境中的氧气 化学方法：在培养基中添加还原剂，降低培养基中的氧化还原电位势。 物理方法：利用特殊的厌氧培养

30、装置 培养兼性厌氧或耐氧微生物：可深层静止培养。,第四节 有害微生物生长的控制,抑菌inhibition:抑制微生物生长，但不能杀死微生物群体的措施。 灭菌Sterilization ：杀死或消除材料或物品上全部微生物的措施。 消毒Disinfection ：杀死、消除或降低材料或物品上的病原微生物，使之不致引起疾病的措施。 防腐Antisepsis ：防止或抑制霉腐微生物生长，但不能杀死微生物群体的措施。,物理方法控制：温度、辐射、过滤除菌、干燥、高渗、超声波等 化学方法控制,第四节 有害微生物生长的控制,1、高温灭菌法是最常用的物理方法。高温可引起蛋白质、核酸等活性大分子氧化或变性失活而导

31、致微生物死亡。,一、有害微生物生长控制的物理方法,（一）温度,干热灭菌法 湿热灭菌（消毒）,焚烧法（incineration）：是将被灭菌物品在火焰中燃烧，使所有的生物质碳化。简单、彻底，但对被灭菌物品的破坏极大。适用于无经济价值的物品（如死亡动物尸体、污染材料等）灭菌，及不怕烧的实验器具，如接种环、镊子、试管或三角瓶口的灭菌等。,干热灭菌法,干燥热空气灭菌法(hot-air oven)：将物品放入烘箱内，然后升温至150170 ，维持12小时。适用于玻璃、陶瓷和金属物品的灭菌，不适合液体样品，及棉花、纸张、纤维和橡胶类物质的灭菌。 特点：由于空气传热穿透力差，菌体在脱水状态下不易杀死，所以温

32、度高、时间长。,特点：温度低、时间短、灭菌效果高 菌体内含水量越高，则凝固温度越低； 饱和水蒸汽穿透力强； 蒸汽冷凝会放出潜热； 湿热易破坏细胞内蛋白质大分子的稳定性，主要破坏氢键结构。,2、湿热法,在同样温度下湿热灭菌效果要比干热好,湿热灭菌,常压法 煮沸消毒法 巴斯德消毒法 加压法 常规加压蒸汽灭菌法 连续加压蒸汽灭菌法,高压蒸汽灭菌法 利用水的沸点随水蒸气压力的增加而上升，以达到100 以上高温灭菌的方法。 方法：121（1kg/cm2或15磅/英寸2）维持15-20min。112（0.5kg/cm2或8磅/英寸2）20-30min。115（0.75kg/cm2或11磅/英寸2）20-3

33、0min。 应根据灭菌物品的性质或成分选择灭菌温度 例如：生理盐水、营养琼脂等培养基用121 。含葡萄糖、乳糖、氨基酸等培养基用112 。 适用：耐高温物品，玻璃仪器、含水或不含水的物品。,高 压 蒸 汽 灭 菌 锅,注意事项： 排净冷空气； 灭菌终了，缓慢降压； 灭菌结束，趁热取出物品。,煮沸消毒法 将水加热至100，煮沸15min30min，可杀死所有营养细胞和部分芽孢，达到消毒物的目的。 巴斯德消毒法（Pasteurization）： 用较低的温度来杀死其中的病源微生物，这样既保持食品的营养风味，又进行了消毒 低温长时法(Low temperature long time,LTLT)；6

34、2.930min处理牛奶，迅速冷却 高温瞬时法（Hightemperatureshorttime,HTST):71.615s处理牛奶 超高温巴斯德灭菌法(Ultrapasteurization):让液体食品停留在140左右3-4s，急剧冷却至75，经匀质化后冷却至20。,间歇灭菌法：将待灭菌物品在80-100蒸煮15-60min，冷却后搁置室温（28-37）下过夜，并重复以上过程三遍以上。 其蒸煮过程可杀死微生物的营养体，但不能杀死芽胞，室温过夜促使残留的芽孢萌发成营养体，再经蒸煮过程可杀死新的营养体；循环三次以上可保证彻底灭菌的目的。 适用于不耐高温的物品灭菌，如不适于高压灭菌的特殊培养基、

35、药品的灭菌。 缺点是麻烦、费时。,高温对培养基的影响,高温对培养基的不利影响： 会产生混浊或形成不溶性沉淀 营养成分被破坏（ PO4-3存在，葡萄糖生成酮糖，菌不利用）； 色泽加深（褐变如产生氨基糖等）； 改变培养基的pH值（通常下降0.2） ； 形成有害物质，抑制微生物生长；,低温低温是通过降低酶反应速度使微生物生长受到抑制。 冷藏法：5，微生物斜面菌种放置冷藏箱中可保存数周至数月而不衰竭死亡；食品保鲜 冷冻法：食品工业中采用-10左右的冷冻温度较长时间地保藏食品；冷冻法也可用作菌种保藏，但所需温度更低，如-80低温冰箱、或-78干冰、或-80液氮中冷冻保存。,2、低温抑菌,（二）辐射作用,

36、电磁辐射：微波、可见光、紫外光电离辐射：、射线 。,辐射：是能量通过空间传递的一种物理现象。,有害微生物生长控制的物理方法,机理：微波产生热效应，使蛋白质、酶等物质变性，导致微生物死亡。 特点：加热均匀，热能利用率高、加热时间短。 应用：食品消毒、灭菌。,（1）微波辐射,波长在400800nm的电磁辐射为可见光。 大部分微生物不需要光，少数菌需要光作为能源。 一般来讲，可见光对大多数化能微生物没有影响，但是，太强或连续长时间照射也会导致微生物死亡（光氧化作用）。,（2）可见光：,波长在100 400nm的电磁辐射为紫外线。 紫外线杀菌或诱变原理： 紫外线作用于DNA ，使其产生胸腺嘧啶二聚体，

37、引起DNA结构变形，阻碍正常的碱基配对，从而造成微生物变异或死亡。 紫外线会使空气中的分子氧变成臭氧，臭氧释放的原子氧有杀菌作用。 其中波长在260 280nm处的紫外线杀菌力最强。主要因为核酸（DNA、RNA）的吸收峰为260nm，蛋白质的吸收峰为280nm。,(3)、紫外线（）,缺陷： 穿透力差； 光修复作用,紫外线灭菌 使用紫外灯照射，可以根据1W/M3来计算剂量，若以面积计算，一般30W的紫外灯可用于15M2的房间消毒，照射时间为2030分钟，有效照射距离为1米左右,光复活现象：经紫外线照射的微生物，在可见光下，光可以激活DNA修复酶，该酶能修复DNA上的损伤，使微生物的突变率或死亡率

38、下降。,应用：由于穿透力差，只适用于物体表面以及空气、水的消毒杀菌，也用于诱变育种。,2、电离辐射： 、射线 ，波长短，能量高，有较强的杀伤力。 作用原理 ：可引起水和其他物质的电离，产生游离基，使核酸、蛋白质或酶发生变化，造成细胞损伤或死亡。 特点：穿透力强，非专一性，作用于一切细胞成分，对所有生物均有杀伤作用。 应用：用于杀菌或菌种诱变。,射线灭菌 Co60放射性元素可放出射线。 灭菌剂量：2050KGY,采用滤孔比细菌还小的筛子或滤膜作成各种过滤器，当空气或液体流经筛子或滤膜时，微生物不能通过滤孔而被阻留在一侧，从而达到灭菌的目的。但不能除去病毒。,（三）过滤除菌法,过 滤介质： 发酵工

39、业：棉花、玻璃纤维、石棉、滤纸 实验室：硝酸纤维薄膜、聚碳酸胶片（核辐射和化学刻蚀处理,滤器孔径：常用0.22 m 、0.45 m 。,在高渗溶液中,细胞易失水,脱水后发生质壁分离,生长受抑制或死亡.(盐渍和糖渍保藏食品) 在低渗溶液中,细胞吸水膨胀,甚至导致细胞破裂死亡.,（四）高渗作用,对于一般微生物来说，在含盐5%30%或含糖30%80%的高渗条件下可抑制或杀死某些微生物。但各种微生物承受渗透压的能力不同，有些能在高渗条件下生长，称其为耐高渗微生物。,糖饯食品、盐腌食品,干燥抑制微生物生长或造成其死亡的原因： 干燥能引起微生物细胞内蛋白质的变性和盐类等物质浓度提高，从而抑制生长或造成微生

40、物死亡,（五）干燥,微生物对干燥的抵抗力与以下因素有关： 温度： 在相同的干燥环境下，温度高，微生物易死亡， 而在低温下不易死亡（例如冷冻干燥保藏菌种） 干燥速度：干燥速度快，微生物不易死亡，反之，易死亡 基质：在不同基质中对干燥的抵抗力不同，含有糖、淀粉、蛋白质等物质时，不易死亡。 微生物种类及生长时期：产荚膜菌比不产荚膜菌抗性强；小型、厚壁细胞的微生物比长型、薄壁细胞的微生物抗性强；细菌的芽孢、真菌的孢子比营养细胞抗干燥性很强；老龄菌比幼龄菌抗性强。,超声波：每秒钟振动在1600以上的声波。 机理：空穴作用，引起膜破坏，细胞破裂，内涵物逸出。 应用： 破碎细胞，提取胞内物质（代谢产物、酶等

41、） 杀菌,超声波杀菌效力大小与频率、强度、处理时间等多种因素有关。,（六）超声波,新的杀菌技术非热杀菌技术,超高静压杀菌技术：密封于弹性容器内的灭菌物品置于水或其它液体作为传压介质的压力系统中，经100MPa以上的压力处理，以达到杀菌，灭酶和改善食品的功能特性等作用。 脉冲电场杀菌技术：将被杀菌对象置于两个电极间产生的瞬间高压电场中，由于高压电脉冲能破坏细菌的细胞膜，改变其通透性，从而杀死细胞。 振荡磁场杀菌技术：采用6000的磁力强度，将被杀菌对象放在N极与S极之间，经过连续摆动，不需加热，即可达到100%的杀菌效果，对食品的成分和风味无任何影响。 脉冲光杀菌技术：采用持续时间短、光照强度高

42、的宽谱白光脉冲照射被杀菌对象以达到杀菌目的的一种杀菌技术。,非热杀菌技术优势,能在常温或较低温度下达到杀菌，灭酶的作用，与传统的热处理相比，减少了由于高热处理引起的食品营养成分和色、香、味的损失或劣化 由于传压、磁和电速度快，均匀，处理不受食品的大小和形状的影响，处理过程较为简单 耗能较少,二、微生物生长繁殖的化学控制,消毒剂和防腐剂化学治疗剂,消毒剂:可以抑制或杀灭微生物，但对人体也可能产生有害作用的化学试剂.主要用于抑制或杀灭物体表面、器械、排泄物和环境中的微生物。 防腐剂:可以抑制或阻止微生物生长，但对人体或动物体的毒性较低的化学药剂.用于肌体表面，如皮肤、粘膜、伤口等处防止感染，也有的

43、用于食品、饮料药品的防腐作用。,（一）消毒剂和防腐剂,消毒防腐剂的作用机理: 使微生物蛋白质凝固变性 破坏菌体的酶系统 降低微生物表面张力,增加细胞膜的通透性,常用的消毒防腐剂及其应用,常用的消毒防腐剂及其应用,常用的消毒防腐剂及其应用,概念：化学治疗剂是指那些能够特异性地作用于某些微生物并具有选择毒性的化学药剂，它们与非特异的化学药剂相比对人体几乎没有什么毒性或毒性很小，可用作治疗微生物引起的疾病。 既适用于涂抹肌体表面，也始于通过口服或注射吸收到体内。,（二）、化学治疗剂,种类： 抗代谢药物人工合成的 抗生素微生物所产生的,1、抗代谢类药物:,概念：有些化合物在结构上与生物体所必需的代谢物

44、很相似，以致于可以和特定的酶结合，从而阻碍酶的功能，干扰代谢的正常进行，这些物质叫抗代谢物（antimetabolite)，用于疾病治疗，称抗代谢类药物。,抗代谢物-磺胺类,二氢蝶啶+ 对氨基本甲酸 二氢叶酸 四氢叶酸 辅酶F磺胺药 核酸合成,二氢叶酸合成酶,二氢叶酸还原酶,磺胺药作用机理：,细菌需要利用对氨基本甲酸合成生长所需的叶酸：,抗代谢物,磺胺药对氨基苯甲酸 ； 6 - 巯基嘌呤嘌呤； 5 - 甲基色氨酸氨基酸； 异烟肼吡哆醇。,2、抗生素（Antibiotic）：,传统含义：是指一类由微生物代谢过程中产生的具有在低浓度下抑制或杀死它种微生物作用的次生代谢产物。,广义的抗生素：微生物（

45、或其他生物）产生的或半合成的一些在低浓度下能抑制或杀死微生物以及具有其他生理活性如抗癌、抗虫、免疫抑制作用、调节植物生长等作用的物质。,什么是抗生素？：,抗生素的发现,1929年 A.Fleming,antibiotic的抗菌效能的评价：,抗菌谱：抗生素的作用对象有一定范围，这种作用范围称该抗生素的抗菌谱。广谱：对多种微生物有作用（如：土霉素、四环素）；窄谱：仅对某一类微生物有作用（如：多粘菌素 效价单位：效价是衡量抗生素制品有效成分多少的计量单位 ，一般是用抗生素的重量作为单位，如链霉素，规定1mg的游离碱为1000单位， 最小抑菌浓度（MIC）：在一定的条件下，某抗生素抑制特定微生物生长的

46、最低浓度,抗生素的作用机制：,1抑制细胞壁合成2损伤细胞膜3抑制蛋白质合成4干扰核酸的合成 5 . 抑制呼吸链,如D-丝氨酸、磷霉素、青霉素、头孢霉素、杆菌肽等。,如多粘菌素和短杆菌肽 ；制霉菌素、两性霉素 。,如四环素、卡那霉素、链霉素、氯霉素、金霉素、红霉素 。,如利福霉素、放线菌素、D新生霉素 等。,如抗霉素,抑制细胞壁的功能：如青霉素、头孢霉素、磷霉素等,影响细胞膜的功能：如两性霉素等,微生物的抗药性 缺少高效、低毒的抗真菌药物 缺少抗病毒、抗肿瘤的抗生素,存在问题：,微生物的抗药性产生的机制：,练习：下类物品或材料用什么措施来消毒（灭菌）比较合适？,牛肉膏蛋白胨培养基 马铃薯葡萄糖培养基 血清 酶制品 培养皿 移液管 微生物培养室 工作服 手术器械,组织块 罐头 牛奶 室内空气 表面创伤 接种工具 皮肤表面,本章习题,从实际应用、优缺点等方面比较分析显微镜直接计数法、菌落计数法、比浊法和重量法等测定微生物群体生长的方法。 氧对不同类群微生物具有什么影响？请从生化机理上进行解释。 在封闭系统中微生物的生长经历哪几个时期，如何利用微生物的生长规律来知道生产实践？ 比较化学消毒防腐剂、抗生素和抗代谢药物的异同并举例说明。,