1、第六章 GMP 中的微生物检验,GMP （good manufacturing practice ）：生产质量管理规范,空气中有大量微生物存在，种类多，分布不均匀，通常宿舍空气中含20000个/m3，街道5000个/m3 ，是传播疾病的主要媒介之一。室内空气的卫生标准夏季菌落总数小于1500个/m3 ，冬季少于4500个/m3 。溶血性链球菌和绿色链球菌夏季少于26 /m3 ，冬季少于36 /m3 。,目前洁净厂房已成为食品和药品生产的基本要求，测定它们的物理和微生物环境条件，已成为质量控制的组成因素。微生物常常是黏附在1020微米粒子上。因此，洁净厂房的微生物学评估是对生产环境监控的不可缺少
2、的指标，它涉及到洁净状况，灭菌消毒状况的有效性。通过对厂房环境的微生物监督和物理分析结果，可判断在该环境中进行生产活动的可靠性。本章主要介绍GMP 中空气洁净度标准、空气洁净度的微生物检测技术，包括采样计划的制定、采样位置的确定、浮游菌的测试、沉降菌的测试,209E空气洁净度标准,一、空气洁净度标准,1 英制（粒/ft3） ：美国联邦标准209E 是国际上最通行最著名的洁净室标准，许多国家的洁净度分级基本参照美国标准。,2 公制（粒/L） ：原苏联、澳大利亚标准，分三级。,3 国际公制（粒/米3） ：采用国际公制的有世界卫生组织（WHO）、欧共体（EEC）、德、日、英、中国。 WHO和EEC标
3、准分四级,我国的级别标准(国家食品药品监督管理局),虽然国际公制的粒/米3最有通用性，但是在计量监测仪器方面，目前还需用英制中每立方英尺颗粒数（ft3）乘35倍，或用公制中每升颗粒数乘以1000来换算。,虽然，洁净室内空气含尘量与含菌量没有一定的比例关系，但一般认为微粒少的洁净室，微生物量也较少。因此，制药工业为减少微生物污染，各工序、各品种采用了不同的洁净度级别。我国的GMP药品生产各工序的空气清洁度级别主要是： 不能终端高压灭菌的注射剂的调配室，100级； 能终端高压灭菌的注射剂的调配室，1万级； 粉针剂原料药的调配室,100级； 口服液的调配室,1万级。,二、洁净环境中微生物学 警告水平
4、和行动水平的建立,许多制药厂对洁净环境微生物污染监督参数使用两个水平：一个是警告水平（alert level），一个是行动水平(action level)。两个水平是依据经验资料积累形成的。以这两个水平条件下进行无菌生产的药品，其微生物学质量不会有任何问题，如果超过这两个规定的水平，就要判定会造成什么影响。,1 警告水平是依据从各个净化厂房或生产步骤得到的经验和资料，一个合适的数值是95%置信值（即每20个结果有一个结果超过此限度），意义是生产中净化厂房和生产步骤情况发生变化，但还未造成直接影响时发出警告。超过警告水平限度要及时监督调查，找出微生物数量增加原因，但不必进行校正工作。许多厂商制定
5、的警告水平可分为两级,并且不同设备的警告水平也可不同。,2 行动水平,是批准产品的发放水平。 超过此限度将表示用这样生产步骤生产的药品，微生物质量得不到保证，超过行动水平需立即调查，并进行校正。 不同的厂房和设备行动水平都是相同的。目的是保证控制环境的一致性。 但由于采样系统、培养基和培养温度不同，所得出的微生物水平的数据会不同。,三、模拟生产操作步骤微生物学评估,模拟生产操作步骤微生物学评估可采用培养基灌封试验。必须在无菌生产批结束时立即进行，以证明批生产中无菌保证条件的状况。 培养基灌封试验经过3次模拟运转合格，该洁净室或控制环境的生产线微生物状况就算合格。 一般采用大豆消化酪素肉汤培养基
6、进行灌封试验。 在20-25及30-35 ，各培养7天。 洁净室最重要的污染源是人员，污染率取决于无菌操作区操作者的操作活动,四、空气洁净度的检测方法,1、制定采样计划和采样位置的关键因素 可能与产品接触的空气和表面区域 关键区域要比非产品接触区域有较严格监督； 高数量人员活动处有较严格监督 非肠道使用药瓶装置运作区域，如瓶塞碗中瓶塞的装置，药瓶灌注线上瓶子的补充，人员常规操作涉及的瓶子的消毒 建立定期的微生物学监督程序：工作人员接触产品可能性大的区域，无菌产品的无菌操作过程，终端灭菌产品的定期监督,2、采样频率 采样频率是由该控制区域的重要性以及药品加工步骤所决定的。,浮游菌测试最少采样点数
7、目,最小采样量：日常监测：100级600L /次，10000级400L /次，1000000级50L /次；环境验证：100级1000L /次，10000级500L /次，1000000级100L /次。,3、我国的相关规定我国对医药工业洁净室和控制区，浮游菌（GB/T16293-1996）和沉降菌（GB/T16294-1996）的测试国家标准规定测试方法中制定了测试规则，就测试状态、测试人员要求、测试时间、采样点数量及布置，最少采样点数目，采样次数都有明确规定。,在满足最少测点数的同时，满足最少培养皿数（90mm ），100级14个，10000级2个，1000000级2个,3 洁净室采样点布
8、置：力求均匀，避免采样点在某局部区域过于稀疏。可在关键设备或关键工作活动范围处增加测点。,4、设备撞击式空气微生物采样器离心式空气微生物采样器狭缝式空气微生物采样器,浮游菌空气采样器MAS-100 87430,5 测定方法 （1）浮游菌测数采用计数浓度法，通过收集悬浮在空气中的生物性粒子于专门的培养基经规定时间的培养，在适宜生长条件下让其繁殖到可见菌落时计数，从而判定洁净环境内单位体积空气中的活微生物数。被测洁净室的各项状态指标必须在规定值内，且已消过毒无论静态和动态测试，都必须符合生产要求。,用计数法得出各个培养皿的菌落数。 平均浓度（个/m3）=菌落数/采样量如在某测点采样400L，菌落数
9、为1，则：平均浓度=1/0.4=2.5 （个/m3）如某测点采样2 m3 ，菌落数为3，则平均浓度=1.5 （个/m3） 培养温度在30-35度，48h。每个测点的浮游菌平均浓度判断洁净厂房空气中的微生物数。若某测点的浮游菌平均浓度超过评定标准，则必须对此区域先行消毒，重新采样两次，两次测试结果必须合格。,(2)沉降菌测试,在灵敏度方面，采用14cm直径平板达到的净化度较高。 C=（D602）/（AT）C：控制区空气中细菌浓度 D：沉降细菌4个平板平均数 A：平板面积（cm2）1只，14cm平板=154 cm2 T：平板暴露时间（小时）,五、微生物环境控制程序荷兰的RIVM 监督程序在洁净室的微生物环境控制程序包括：设备、装置和人衣服表面取样。不同的设施和环境应用不同的控制程序,降低微生物的污染率屏障：保持物料不暴露在周围环境中。 吹/灌/封一体装置体系： 隔离装置：防止微生物污染，保护操作人员,
