1、.页眉.页脚HPLC 测定维生素 D 滴剂（胶囊型）中维生素 D3的含量药学 092 夜本(26092106) 张佳荣摘要：国际对维生素 D 的大量深入研究显示：维生素 D 不再被认为是仅仅用于预防儿童佝偻病的营养必需品。市面上存在大量各种厂家的维生素 D3 的产品，但中国药典并未收录维生素 D3 滴剂的含量相关检测方法。关键词：维生素 D 滴剂（胶囊型） ，维生素 D3，正相 HPLC，反相 HPLC1.研究背景1.1 研究意义近年来，国际对维生素 D 的大量深入研究显示：维生素 D 不再被认为是仅仅用于预防儿童佝偻病的营养必需品。维生素 D 对健康的意义被更加广泛的认知，并在大量临床试验中
2、得到证实，这其中包括：降低常见癌症的发生率，如乳腺癌、肺癌、结肠癌等。 防治自身免疫性疾病、高血压和感染性疾病等。维生素 D 调节胎盘的发育和功能，这表明孕妇维持较好的维生素 D 水平可预防如流产，先兆子痫，和早产等妊娠并发症的发生。宫内及婴幼儿获得足够的维生素 D 可降低 1 型糖尿病，哮喘与精神分裂症的发生率。 总的来说，维生素 D 缺乏的治疗和预防对于所有人群，尤其是妇女儿童的整体健康发展是非常重要的。大多数的维生素 D 由 DBP(维生素 D 结合蛋白质)或脂蛋白携带到肝脏，在侧链 C-25 位上羟化形成 25-（OH）D 3,它是主要的循环形式。维生素 D25 羟化酶包括两种形式的细
3、胞色素 P-450 混合功能氧化酶，一种在内质网上的低亲和力高容量酶，另一种则是在线粒体上的高亲和力低容量酶，25 羟化酶主要受维生素 D 在肝脏的浓度调节，几乎不被 25-（OH）D 3 抑制。25-（OH）D 3 不储存在细胞内，它被释放到血浆中和DBP 结合，在正常的 25-（OH）D 3 的血浆浓度时，仅有少量的 25-（OH ）D 3 从血浆释放入组织。因此 25-（OH）D 3 的循环水平是良好的维生素 D 营养状况的测试指标。维生素 D 的缺乏与摄入量以及日照时间有关，所以很难确切估计。但就目前紫外线照射带来的皮肤癌等问题上升的情况下，各国人群接受日照的时间都在减少，并且很多国家
4、明确规定要限制接受日照的时间，因此全世界范围内维生素 D 均呈现广泛缺乏的现象。 中国部分居民血液中的 25-（OH）D 3 水平检测发现，约 60%以上的居民为缺乏，.页眉.页脚只有约 6%的人群达到优秀水平。其中，最易缺乏，并因为缺乏容易出现疾病的人群包括：孕妇、婴幼儿、老年人。这主要与这三类人群接受日照时间都相对较少有关。2000 年中国营养学会制定的中国居民膳食维生素 D 推荐摄入量见表 1.1。 年龄（岁） IU/d 年龄（岁） （单位 IU/d）010 400 孕妇 4001149 200 乳母 40050 400表 1.1：中国居民膳食维生素 D 推荐摄入量世界各国对维生素 D
5、需要量指导：中华医学会儿科学分会（2008 年 3 月）：早产儿、低体重儿、双胞胎：2 周后800IU/d，三个月后 400IU/d。纯母乳喂养的婴幼儿：2 周-2 岁，400IU/d。配方奶喂养儿：如果奶量少于 500ml，补充 200IU/d。妊娠后期为秋冬季的孕妇：400-1000IU/d，同时监测 25-(OH)D3 浓度。美国儿科学会临床指南（2008 年 11 月）：与中国相比，提前和延长了补充维生素D 的年龄段，孕妇（妊娠后期） 、乳母，不管什么季节都需要补充维生素 D 400-1000 IU/d。在包括美国、澳洲等世界发达国家的各类医学文献中，对各个人群的维生素 D 推荐剂量，
6、均高于目前中国的推荐剂量，综合下来见表 1.2。年龄（岁） 推荐摄入量（单位 IU/d）019 400-10002050 400-10005169 1000-200070 1000-2000表 1.2: 个人群的维生素 D 推荐剂量通过膳食来源的维生素 D 一般不会引起中毒，也就是说天然的维生素 D，和食品级的天然维生素 D 补充剂一般不会引起中毒。而大剂量的化学维生素 D 和强化维生素D 的奶制品有发生维生素 D 过量和中毒的可能。中国营养协会建议我国儿童和成人的可耐受最高摄入量为 800IU/d。但从目前国际对 D3 的应用看来，大部分国家在日照较少的季节，对婴幼儿的日摄入量已经提高到 8
7、00-1000IU/d，而孕妇和普通成人如果检测为维生素 D 缺乏，在开始 1-2 个月，日摄入量会要求提高到 2000 IU/d 甚至更多。 医学分析表明，将维生素 D 摄取量增至 1000IU/d 可能降低结肠癌和乳腺癌的患病几率 50%。男性摄入维生素 D400IU/d 可大幅降低患多种癌症的几率，包括胰腺癌、食道癌和非霍奇金淋巴瘤。孩子在生命的第一年期间每天摄入 2000IU 的维生素 D，在 30年随访期间 1 型糖尿病的风险降低 80。.页眉.页脚1.2 药物的来源维生素 D 是一种脂溶性维生素，也被看作是一种作用于钙、磷代谢的激素前体，它与阳光有密切关系，所以又叫“阳光维生素”
8、。维生素 D 是一族 A、B、C、D 环结构相同，但侧链不同的一类复合物的总称，A、B、 C、D 环的结构来源于类固醇的环戊氢烯菲环结构，目前已知的维生素 D 至少有 10 种，但最重要的是维生素 D2（麦角骨化醇）和维生素 D3（胆钙化醇） 。 维生素 D2 是紫外线照射植物中的麦角固醇产生，在自然界存在较少。维生素 D3 则由大多数高级动物的表皮和真皮内含有的 7-脱氢胆固醇经紫外线（波长 265228nm）照射转变而成。维生素 D3 是维生素 D 中生物代谢率最高的一种活性形式。在后文中提到的维生素 D 主要指维生素 D3 维生素 D3（胆钙化醇）主要是由人体自身合成的，人体的皮肤含有一
9、种胆固醇，经阳光照射后，就变成了维生素 D3。所以，如果孩子能充分接受阳光的话，自身合成的维生素 D3，就基本上能满足。另外，维生素 D3 还可来自动物性食物，如肝类，尤其是由海产类的鱼肝中提炼的鱼肝油。维生素 D3 除存在于少数动物性食物之外，主要是皮肤中的 7-脱氢胆固醇经紫外线照射后形成的，而 7-脱氢胆醇则是由胆固醇转变生成的，所以有人叫它太阳维生素。 1936 年，人们从鳕鱼中发现了维生素 D3。以后发现了维生素 D3 的生理功能是促进肠道钙吸收，诱导骨质钙鳞沉着和防止佝偻病。维生素 D3 对钙代谢的调节是通过与胞核 1，25- （OH ） 2D3 受体的结合而达到的。不久人们又发现
10、，在 皮肤、肌肉、胰腺、脑、造血细胞和肿瘤细胞中发现均有这种受体。1981 年有人首先在小鼠的骨髓白血病细胞中发现，维生素 D3 具有调节细胞生长的作用，包括诱导细胞的正常分化和抑制细胞的过渡增殖。由此，人们联想到能否用维生素 D3 来治疗肿瘤、银屑病等细胞过渡增殖的疾病。但直接应用维生素 D3 及时美籍日记未可也能导致高钙血症、高钙尿症和软组织钙化。丹麦利昂公司为了找出一种维生素 D3 的衍生物，既能调节细胞生长，对钙代谢的影响不大，并终于在 1985 年合成钙泊三醇。与此同时日本学者用 1-OHD3 治疗一老年骨质疏松患者，意外发现其银屑病亦好转。日本株式会社也合成他骨化醇。钙泊三醇与他骨
11、化醇可外用治疗银屑病。钙泊三醇与他骨化醇都是维生素 D3 的类似物，均能抑制银屑病表皮细胞的异常增值，及诱导银屑病表皮细胞的分化。这是他们治疗银屑病所以有效的道理。维生素 D3 以海肝含量最为丰富，如每 100 克鳕鱼、比目钱及剑钱肝中分别含维生素 D3200750 微克、50010000 微克、25000 微克。其他如鲱鱼、鲑鱼、沙丁钽及鲳鲸等含有少量；禽畜肝脏、蛋类和奶类也是含有少量，每 100 克含量在 100 微克以下。在一般情况下，单靠从食物中获得足够的维生素 D3 是不容易的，所以通过日光浴在体合成维生素 D3 是一个别重要途径。1.3 维生素 D3 的临床应用及大剂量的毒性.页眉
12、.页脚维生素 D 除防治维生素 D3 缺乏病外 1-25（OH） 2D3 可防治下列病症： 肾性骨病，肾功能不全缺少 1 位羟基化酶，体内不能合成 1-25（OH） 2D3 必须从体外摄取； 难治疗抗维生素 D3 佝偻病，由于遗传因素，磷从肾排出过多； 甲状旁腺素缺少症，患者不能在低血浆 Ca 时产生 1-25（OH） 2D3； 抗维生素 D 的佝偻病，维生素 D 供应正常但仍有佝偻病，由于代谢上的缺陷，不能 1 位羧基化；癫痫病人使用苯巴比妥可能导致骨病。也可用 25（OH） 2D3 的生理剂量为 1g/天。此剂量也可作为治疗剂量。维生素 D 中毒剂量与生理剂量相差不多，婴儿服用 50g（2
13、00IU）或更少一些可以导致血钙过多，肾功能不全。成人中毒剂量个体差异较大，有人口服 2000IU 中毒现象，口服 5000IU 者易中毒，口服量不能超过 800IU。用维生素 D 治疗时，要检查血钙水平，如血钙正常不致中毒，轻度中毒有呕吐，食欲不振等现象，重者可致死亡。维生素 D 毒性可由于血流中 25（OH） 2D3 水平高代替 1-25（OH） 2D3 与蛋白受体结合，因此 1-25（OH ） 2D3 不能进入细胞，也不能起控制钙的吸收及动员骨钙的作用，因此血钙水平高，而使肾、心脏及主动脉钙化，治疗维生素 D 过多时可用低钙膳及动员骨钙的作用，因此血钙水平高，而使肾、心脏及主动脉钙化，治
14、疗维生素 D 过多时可用低钙膳及糖皮质激素以减低血清钙的水平。中毒时尿中排出 Ca 量过多比血钙过高发生较早，尿钙过高易形成肾结石。维生素 D 及 25（OH）D 3 可以储存，维生素 D 储存时间一般为 14 个月，有的可达 18 个月之久。维生素 D 代谢物也可产生中毒现象，但由于其生物半衰期短，中毒时间也较短，25（OH）D 3 可达数周，1-25（OH） 2D3 仅有数日。.页眉.页脚2.文献综述维生素 D3 的含量测定参考方法：2.1 参考方法 1：对照品贮备溶液的制备 根据各制剂中所含维生素 D 的成分,精密称取相应的维生素 D3 对照品 25mg，置 100ml 棕色量瓶中，加异
15、辛烷 80ml，避免加热，用超声处理助溶 1 分钟使完全溶解，加异辛烷至刻度，摇匀，充氮密塞，避光，0以下保存。内标溶液的制备 称取邻苯二甲酸二甲酯 25mg，置 25ml 量瓶中，加正己烷至刻度，摇匀。 色谱条件与系统适用性试验 用硅胶为填充剂，正己烷正戊醇（9973）为流动相，检测波长为 254nm。校正因子测定 精密量取对照品贮备溶液和内标溶液各 5ml,置 50ml 量瓶中，加正己烷至刻度，摇匀；取一定量注入液相色谱仪，计算维生素 D 的校正因子 f1。另精密量取对照品贮备溶液 5ml 置 50ml 量瓶中，加入 2,6二叔丁基对甲酚结晶1 粒,通氮排除空气后，密塞，置 90水浴中加热
16、 15 小时，取出迅速冷却至室温，精密加内标溶液 5ml，加正己烷至刻度，摇匀；取一定量注入液相色谱仪，计算前维生素 D 折算成维生素 D 的校正因子 f2。 含量测定 取各该制剂项下制备的供试品溶液进行测定，计算维生素 D 及前维生素 D 折算成维生素 D 的总量。 2.2 参考方法 2：对照品贮备溶液的制备 根据各制剂中所含维生素 D 的成分,精密称取相应的维生素 D3 对照品 25mg，置 100ml 棕色量瓶中，加异辛烷 80ml，避免加热，用超声处理助溶 1 分钟使完全溶解，加异辛烷至刻度，摇匀，充氮密塞，避光，0以下保存。内标溶液的制备 称取邻苯二甲酸二甲酯 25mg，置 25ml
17、 量瓶中，加正己烷至刻度，摇匀。 色谱条件与系统适用性试验 用硅胶为填充剂，正己烷正戊醇（9973）为流动相，检测波长为 254nm。校正因子测定 精密量取对照品贮备溶液和内标溶液各 5ml,置 50ml 量瓶中，加正己烷至刻度，摇匀；取一定量注入液相色谱仪，计算维生素 D 的校正因子 f1。另精密量取对照品贮备溶液 5ml 置 50ml 量瓶中，加入 2,6二叔丁基对甲酚结晶1 粒,通氮排除空气后，密塞，置 90水浴中加热 15 小时，取出迅速冷却至室温，精密加内标溶液 5ml，加正己烷至刻度，摇匀；取一定量注入液相色谱仪，计算前维生素 D 折算成维生素 D 的校正因子 f2。.页眉.页脚供
18、试品制备 精密称取供试品适量(相当于维生素 D 总量 600 单位以上，重量不超过 2.0g)，置皂化瓶中，加乙醇 30ml、抗坏血酸 0.2g 与 50(g/g)氢氧化钾溶液 3ml若供试量为 3g，则加 50(g/g)氢氧化钾溶液 4ml，置水浴上加热回流 30 分钟，冷却后，自冷凝管顶端加水 10ml 冲洗冷凝管内壁，将皂化液移至分液漏斗中，皂化瓶用水60100ml 分数次洗涤，洗液并入分液漏斗中，用不含过氧化物的乙醚振摇提取 3 次，第一次 60ml,以后每次 40ml，合并乙醚液，用水洗涤数次，每次约 100ml，洗涤时应缓缓旋动，避免乳化，直至水层遇酚酞指示液不再显红色，静置，分取
19、乙醚提取液，加入干燥滤纸条少许振摇除去乙醚提取液中残留的水分，分液漏斗及滤纸条再用少量乙醚洗涤，洗液与提取液合并，置具塞圆底烧瓶中，在水浴上低温蒸发至约 5ml，再用氮气流吹干，迅速精密加入甲醇 3ml，密塞，超声处理助溶后，移入离心管中，离心，取上清液作为供试品溶液 A。净化用色谱柱系统分离收集维生素 D，精密量取上述供试品溶液 A 500l,注入以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的液相色谱柱，以甲醇乙腈水(50 50 2) 为流动相进行分离，检测波长为 254nm，从计录仪上观察色谱图，要求维生素 D 与前维生素 D 为叠峰，并能与维生素 A 及其他干扰含量测定的杂质分开；准确收集含有维生素
20、D 及前维生素 D 混合物的全部流出液，置具塞圆底烧瓶中，用氮气流迅速吹干，精密加入已知内标浓度的正己烷溶液适量(不少于 2ml，并使每 1ml 中含维生素 D 为 50140 单位，内标物质与维生素 D 的重量比约为 41)，密塞，超声处理助溶，即为供试品溶液 B。含量测定 取供试品溶液 B，进样量为 100200l。计算维生素 D 及前维生素 D折算成维生素 D 的总量。2.3 参考方法 3：色谱条件与系统适用性试验 用硅胶为填充剂，正己烷正戊醇（9973）为流动相，检测波长为 254nm。供试品溶液的制备 精密称取供试品适量(相当于维生素 D 总量 600 单位以上，重量不超过 2.0g
21、)，置皂化瓶中，加乙醇 30ml、抗坏血酸 0.2g 与 50(g/g)氢氧化钾溶液3ml若供试量为 3g，则加 50(g/g)氢氧化钾溶液 4ml，置水浴上加热回流 30 分钟，冷却后，自冷凝管顶端加水 10ml 冲洗冷凝管内壁，将皂化液移至分液漏斗中，皂化瓶用水 60100ml 分数次洗涤，洗液并入分液漏斗中，用不含过氧化物的乙醚振摇提取3 次，第一次 60ml,以后每次 40ml，合并乙醚液，用水洗涤数次，每次约 100ml，洗涤时应缓缓旋动，避免乳化，直至水层遇酚酞指示液不再显红色，静置，分取乙醚提取液，加入干燥滤纸条少许振摇除去乙醚提取液中残留的水分，分液漏斗及滤纸条再用少量乙醚洗涤
22、，洗液与提取液合并，置具塞圆底烧瓶中，在水浴上低温蒸发至约5ml，再用氮气流吹干，迅速精密加入甲醇 3ml，密塞，超声处理助溶后，移入离心管中，离心，取上清液作为供试品溶液 A。净化用色谱柱系统分离收集维生素 D，精密.页眉.页脚量取上述供试品溶液 A 500l,注入以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的液相色谱柱，以甲醇乙腈水(50502) 为流动相进行分离，检测波长为 254nm，从计录仪上观察色谱图，要求维生素 D 与前维生素 D 为叠峰，并能与维生素 A 及其他干扰含量测定的杂质分开；准确收集含有维生素 D 及前维生素 D 混合物的全部流出液，置具塞圆底烧瓶中，用氮气流迅速吹干，加入异辛烷
23、2ml 溶解，通氮排除空气后，密塞，置 90水浴中，加热 1.5 小时后，立即通氮在 2 分钟内吹干，迅速精密加入正己烷 2ml，溶解后，即为供试品溶液 C。对照品溶液的制备 精密量取对照品贮备溶液适量,加异辛烷定量稀释制成每 1ml中约含维生素 D50 单位，精密量取 2ml 置具塞圆底烧瓶中，照供试品溶液制备项下的方法，自“通氮排除空气后”起，依法操作，得对照品溶液。 含量测定 取对照品溶液与供试品溶液 C，交替精密进样 200l，量取维生素 D 的峰值，按外标法计算含量。 2.4 参考方法 4：对照品贮备液（1）的制备 精密称取维生素 D3 对照品 0.025g 于 100m 棕色容量瓶
24、中，加异辛烷 80ml，避免加热，超声 1 分钟使完全溶解，用异辛烷稀释至刻度，摇匀。对照品贮备液（2）的制备 精密量取对照品贮备液（1）5ml 置 50ml 容量瓶中，用异辛烷稀释至刻度，摇匀，充氮密塞，避光，0以下保存。色谱条件与系统适用性试验 用硅胶为填充剂，以正己烷 -正戊醇（997:3）为流动相，检测波长为 254nm。校正因子测定 精密量取对照品贮备液（2）5ml 至 50ml 容量瓶中，用正己烷稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。取 10ul 注入液相色谱仪，记录色谱图，按下式计算维生素 D3 的校正因子 f1。再精密量取对照品贮备液（1）5ml 至 50ml 容量瓶中，加 2,6
25、-二叔丁基对甲酚结晶1 粒，通氮排除空气后，密塞，置 90水浴加热 1.5 小时后，取出，迅速冷却，用正己烷稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液；取 10ul 注入液相色谱仪，记录色谱图，按下式计算维生素 D3 的校正因子 f2。含量测定 取各该制剂项下制备的供试品溶液进行测定，计算维生素 D 及前维生素 D 折算成维生素 D 的总量。2.5 参考方法 5：对照品贮备液（1）的制备 精密称取维生素 D3 对照品 0.025g 于 100m 棕色容量瓶中，加异辛烷 80ml，避免加热，超声 1 分钟使完全溶解，用异辛烷稀释至刻度，摇匀。对照品贮备液（2）的制备 精密量取对照品贮备液（1）5ml
26、置 50ml 容量瓶中，.页眉.页脚用异辛烷稀释至刻度，摇匀，充氮密塞，避光，0以下保存。色谱条件与系统适用性试验 用硅胶为填充剂，以正己烷 -正戊醇（997:3）为流动相，检测波长为 254nm。校正因子测定 精密量取对照品贮备液（2）5ml 至 50ml 容量瓶中，用正己烷稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。取 10ul 注入液相色谱仪，记录色谱图，按下式计算维生素 D3 的校正因子 f1。再精密量取对照品贮备液（1）5ml 至 50ml 容量瓶中，加 2,6-二叔丁基对甲酚结晶1 粒，通氮排除空气后，密塞，置 90水浴加热 1.5 小时后，取出，迅速冷却，用正己烷稀释至刻度，摇匀，作为混合
27、对照品溶液；取 10ul 注入液相色谱仪，记录色谱图，按下式计算维生素 D3 的校正因子 f2。精密称取供试品适量(相当于维生素 D 总量 600 单位以上，重量不超过 2.0g)，置皂化瓶中，加乙醇 30ml、抗坏血酸 0.2g 与 50(g/g) 氢氧化钾溶液 3ml若供试量为 3g，则加 50(g/g) 氢氧化钾溶液 4ml，置水浴上加热回流 30 分钟，冷却后，自冷凝管顶端加水 10ml 冲洗冷凝管内壁，将皂化液移至分液漏斗中，皂化瓶用水 60100ml 分数次洗涤，洗液并入分液漏斗中，用不含过氧化物的乙醚振摇提取 3 次，第一次 60ml,以后每次 40ml，合并乙醚液，用水洗涤数次
28、，每次约 100ml，洗涤时应缓缓旋动，避免乳化，直至水层遇酚酞指示液不再显红色，静置，分取乙醚提取液，加入干燥滤纸条少许振摇除去乙醚提取液中残留的水分，分液漏斗及滤纸条再用少量乙醚洗涤，洗液与提取液合并，置具塞圆底烧瓶中，在水浴上低温蒸发至约 5ml，再用氮气流吹干，迅速精密加入甲醇 3ml，密塞，超声处理助溶后，移入离心管中，离心，取上清液作为供试品溶液 A。净化用色谱柱系统分离收集维生素 D，精密量取上述供试品溶液 A 500l,注入以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的液相色谱柱，以甲醇乙腈水(5050 2) 为流动相进行分离，检测波长为 254nm，从计录仪上观察色谱图，要求维生素 D 与
29、前维生素 D 为叠峰，并能与维生素 A 及其他干扰含量测定的杂质分开；准确收集含有维生素 D 及前维生素 D 混合物的全部流出液，置具塞圆底烧瓶中，用氮气流迅速吹干，精密加入正己烷溶液适量并使每 1ml 中含维生素 D 为 50140 单位，密塞，超声处理助溶，即为供试品溶液 B。含量测定 取供试品溶液 B，进样量为 100200l。计算维生素 D 及前维生素 D折算成维生素 D 的总量。2.6 文献结论：对上述含量测定方法进行了实验对比。发现参考方法 1，参考方法 4，未能排除样品中的杂质干扰，故排除。参考方法 3，方法过于复杂，实验时间过长，并且出现偏差的概率高，故排除。参考方法 5 相对
30、参考方法 2 而言对仪器要求略高，增加了检验成本。故采用参考方法 2 的检验方法的基础上在加以改进。.页眉.页脚.页眉.页脚3.技术路线3.1 色谱条件ZORBAX 硅胶柱(5m，4.6150mm)，流动相：正己烷 -正戊醇（986:14） ，检测波长：254nm，3.2 阴性试验测试在上述色谱条件下，在样品在色谱的峰是否达到基线分离，且阴性对照无干扰。3.3 线性关系试验测试维生素 D3 的在一定的浓度范围内，与峰面积是否呈良好的线性关系。3.4 精密度试验测试在论文的检测方法下，精密度是否符合标准。3.5 重现性试验测试在论文的检测方法下，重现性是否符合标准。3.6 稳定性测定测试在论文的
31、检测方法下，样品在 6 小时内是否稳定。3.7 回收率试验测试在论文的检测方法下，回收率是否符合标准。3.8 样品含量测定对 3 批次的样品进行含量检测。.页眉.页脚4.进度安排2011 年 6 月至8 月查找并阅读与研究课题相关的文献资料，了解课题的背景、研究目的以及实验方法，翻译其中的外语文献。2011 年 8 月至9 月根据前期所查找的相关文献，完成相关的开题报告，并且做好进入实验室的各项准备工作。2011 年 9 月至10 月进入实验室，熟悉实验操作和流程，试验各种条件对结果可能产生的影响。2011 年 10 月至11 月更具最终确定的实验方法进行实验方法的验证，并进行样品的含量测定2
32、011 年 11 月上旬至11 月中旬整理实验数据，完成毕业论文。2011 年 11 月中旬至11 月下旬修改完善论文，上交论文。.页眉.页脚5.参考文献1 国家药典委员会. 中华人民国药典.二部 .2005维生素 AD 滴剂2 国家药典委员会. 中华人民国.一部.2005 K 维生素 D 测定法 第一法3 国家药典委员会. 中华人民国.一部.2005 K 维生素 D 测定法 第二法4 国家药典委员会. 中华人民国.一部.2005 K 维生素 D 测定法 第三法5 国家药典委员会. 中华人民国.一部.2010 K 维生素 D 测定法 第一法6 国家药典委员会. 中华人民国.一部.2010 K
33、维生素 D 测定法 第二法7 国家药典委员会. 中华人民国.二部.2005维生素 D38 国家药典委员会. 中华人民国.二部.2005维生素 D2 胶丸9 李淑媛. 临床营养学. 北京大学医学出版社. 2006 版10 章有章、查锡良、李刚. 生物化学与分子生物学. 科学技术文献出版社. 2005-10 第 1 版11 The United States Pharmacopieial Convention. United States Pharmacopoeia. USP32-NF27. Oleovitamin A and D12 The United States Pharmacopieial Convention. United States Pharmacopoeia. USP32-NF27. VITAMIN D ASSAY13 British Pharmacopoeia Commission. British Pharmacopoeia 2009. Paediatric Vitamins A, C and D Oral Drops
