1、 氧化应激对 Vero 细胞的损伤及 EGCG 的保护作用摘要：研究了氧化应激对肾细胞 Vero 细胞的损伤及 EGCG 的保护作用。用 MTT、吖啶橙染色和 DNA 凝胶电泳等方法研究了H2O2 和 Cr6+应激对 Vero 细胞的损伤，及 EGCG 对凋亡细胞的保护作用及其机理。结果表明，H2O2 和 Cr6+剂量效应地抑制 Vero 细胞活性，IC50 分别为 175.6 和 9.8mgL-1；其中 50 mgL-1H2O2 和 400 mgL-1/2hCr6+可诱导 Vero 细胞凋亡。060 mgL-1EGCG 有效抑制 H2O2 和 Cr6+应激引起的细胞活性下降，且 40 mgL
2、-1EGCG 显著抑制细胞凋亡。对于 Cr6+所诱导的细胞凋亡，EGCG 的保护作用与 EDTA 和 Vc 的协同作用效果相当，表明清除活性氧和络合金属离子都有助于减轻 Cr6+应激损伤。可见，EGCG 通过清除活性氧和络合离子有效地保护了肾细胞免受应激损伤，这对易遭受活性氧损伤的肾脏无疑具有一定的临床价值。肾病作为一种常见的多发病，严重威胁着患者生命安危。据研究，免疫-炎症-活性氧是引发许多肾病的重要机理，其中活性氧是主要的介导因子1。肾脏是高灌注器官，血流量大、供氧丰富，是机体内最易产生活性氧的器官2。免疫介导的炎症反应、缺血-再灌注、蛋白尿、高血糖等多种因素可引起活性氧的暴发性发生；与此
3、同时，病变肾脏的抗氧化系统失调，活性氧清除能力下降，氧化与抗氧化平衡打破，活性氧大量积累。累积的活性氧极易损伤肾脏。因此，抑制活性氧产生及其损伤对保护肾脏有重要作用。铬是污染环境的重金属之一，电镀、制革、冶炼、燃煤等工业都会带来铬污染。铬及其化合物对肾脏有剧毒，这些化合物通过产生大量活性氧损伤肾脏，导致肾小管坏死、肾功能障碍，甚至肾功能衰竭死亡3。自然界中的铬有 Cr6+、Cr5+、Cr4+、Cr3+等多种价态，除了 Cr3+，其他价态铬均有不同程度的毒性，其中 Cr6+的毒性最大4。因此，本文选择 Cr6（+K2Cr2O7）为氧化应激物，并以 H2O2 为对照，诱导肾正常细胞（Vero）凋亡
4、，建立细胞凋亡模型，进而研究 Cr6+对肾细胞的氧化损伤及 EGCG 对氧化损伤的影响。1 材料与方法1.1 材料与试剂四甲基偶氮噻唑蓝（3-4,5-dimethylthiazolyl-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide,MTT）、吖啶橙（acridine orange,AO）、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）、蛋白酶 K 购自上海生工生物制品公司；二甲基亚砜（dimethylsulfoxide,DMSO）购自盘锦远东锦星化工有限公司。EGCG：购自 Sigama 公司。非洲绿猴肾细胞 Vero 购自中科院上海细胞生物研究所。
5、小牛血清（calf serum）,杭州四季青生物生化制品公司。培养基RPMI1640，LifeTechnologies.Inc.GIBCO.USA。1.2 细胞培养与细胞凋亡模型的建立培养基为 RMPI1640，其中含小牛血清 10%、青霉素 100 U/ml 和链霉素 100 U/ml，在 37含 5%CO2 的细胞培养箱中密闭单层培养Vero 细胞。对数生长期的 Vero 细胞，用 0.02%EDTA 与 0.05%胰酶混合液消化后，稀释成 1105 个mL-1 单细胞悬液，取该细胞悬液 200L 接种于 96 孔板，培养 24 h 后，去掉细胞培养液，加入含不同浓度 K2Cr2O7 的培
6、养液进行应激处理，24 h 后用 MTT 法检测细胞活性，计算 IC50。根据 IC50 选择适宜浓度的 K2Cr2O7 处理细胞，建立细胞凋亡模型。凋亡细胞检测用吖啶橙染色法、流式细胞仪和 DNA 凝胶电泳等方法。吖啶橙染色法检测凋亡细胞形态5。盖玻片培养的细胞，应激处理后，用 5 mgL-1AO 溶液染色 15 min，即用磷酸缓冲液（ PBS，0.01molL-1，pH 6.8）冲洗，然后置于载玻片上，荧光显微镜下观察并拍照。DNA 凝胶电泳6。将待测细胞用裂解液（0.1 molL-1NaCl；10 mmolL-1Tris-HCl,pH8.0；25 mmolL-1EDTA,pH 8.0；
7、0.5%十二烷基磺酸钠）裂解后，用 Proteinase K（终浓度为 50 mgL-1）去除蛋白质，随即加无水乙醇沉淀 DNA，离心 10 min（4，12000g），以 70%乙醇小心冲洗沉淀，自然干燥后，用 Tris 缓冲液（TE，10m molL-1Trise-HCl；1mmolL-1EDTA，pH 8.0）溶解沉淀，并加 RNaseA(终浓度为 50 mgL-1)，于 37温育 1 h，即为DNA 溶液。取 10l DNA 溶液电泳（电压 5 V/cm,时间 2.53 h），成像仪扫描电泳图谱。用一定浓度的 EGCG 预处理 Vero 细胞，然后进行应激处理，检测 EGCG 对凋亡细
8、胞的保护作用。1.3 统计方法：数据用表示，组间差异用 Students t 检验。2 结果与分析2.1 氧化应激对 Vero 细胞的作用及凋亡模型的建立不同浓度的 H2O2 和 Cr6+分别处理 Vero 细胞，24h 后用 MTT 法检测细胞活力。如图 1 所示，H2O2 和 Cr6+成剂量效应地抑制细胞活力，两者对 Vero 细胞的半抑制浓度（IC50）分别为 178.5 和 9.8 mgL-1。可见，两种应激对 Vero 细胞都有一定毒性，Cr6+在低浓度即表现强抑制效应，表明其毒性远远大于 H2O2。同时，根据活性氧作用的瞬时性，测定了 200800 mgL-1H2O2 和 Cr6+
9、对细胞的短时（2h）毒性效应，结果在 2h 内 200800 mgL-1H2O2 和 Cr6+显著降低细胞活性（结果未列出）。根据短时抑制效应，分别选择 600 mgL-1H2O2 和 400 mgL-1Cr6+处理Vero 细胞 2 h，24 h 后电泳检测细胞 DNA，结果两种处理的 DNA呈现明显的电泳梯形条带(图 2)，这是凋亡细胞的典型特征。细胞凋亡过程会发生一系列生化反应，细胞核的主要反应是核酸内切酶被激活，进而使细胞核 DNA 发生降解，产生若干大小不一的寡核苷酸片段，凝胶电泳则出现 DNA 梯形带，该条带被认为是细胞凋亡的重要特征。600 mgL-1H2O2 和 400 mgL
10、-1Cr6+作用 2 h 均使 Vero 细胞产生 DNA 梯形条带，表明两者能诱导 Vero 细胞凋亡。2.2 EGCG 对凋亡细胞的作用根据细胞的毒性效应（结果未列出），080 mgL-1EGCG 对Vero 细胞没有毒性，相反促进 Vero 生长。为此在该浓度范围内研究了 EGCG 对应激细胞的保护作用。图 3 是 EGCG 对凋亡细胞活力的影响。060 mgL-1EGCG 呈剂量依赖性地提高应激细胞活力，其中 40mgL-1EGCG 对应激细胞的保护作用最佳，但当浓度超过 80 mgL-1时，EGCG 的保护作用丧失。DNA 电泳检测表明（图 4），40 mgL-1EGCG 明显抑制
11、H2O2 和 Cr6+应激引起的 Vero 细胞DNA 降解，表明 EGCG 抑制 H2O2 和 Cr6+诱导的 Vero 细胞凋亡。进一步检测 EGCG 对应激细胞形态的影响。图 5 表明，H2O2 和Cr6+应激细胞后细胞质和细胞核 DNA 分别出现桔红色和黄绿色凝聚浓染，而 EGCG 预先处理组细胞的细胞质和细胞核依然保持均匀完整，进一步证明 EGCG 抑制 H2O2 和 Cr6+所诱导的 Vero 细胞凋亡。2.3 EGCG 的作用机理 EGCG 是高效活性氧清除剂，也是天然的金属络合剂，为了明确清除活性氧和络合对氧化应激细胞的作用，用 EDTA 和 Vc 与 EGCG 进行比较。从图
12、 6 可见，EDTA 和 Vc 分别对 Cr6+应激细胞有一定的保护作用，两者协同作用保护效果增强。EGCG 对 Cr6+应激的保护作用强于 Vc 和 EDTA 单独作用，而与 Vc和 EDTA 协同作用效果相当。3 讨论以上结果表明，H2O2 和 Cr6+明显抑制 Vero 细胞活力，且在一定浓度诱导该细胞凋亡。H2O2 是一种活性氧，它可直接损伤细胞，进而诱导细胞凋亡7。对于铬的毒性研究认为是通过间接作用进行损伤的，其机理是铬被细胞吸收后，与还原剂（Vc 和 GSH 等）发生氧化还原反应，产生活性氧与 Cr5+、Cr4+、Cr3+等系列低价态离子，诱导 Fenton 反应而产生OH 等大量
13、活性氧，导致严重损伤8。因此，低浓度 Cr6+即表现强烈的细胞毒性，由此不难理解 Cr6+的毒性远远大于 H2O2。本研究中， EGCG 抑制 H2O2 和 Cr6+诱导 Vero细胞凋亡。活性氧是诱导细胞凋亡的重要因子，EGCG 对 H2O2 诱导细胞凋亡的抑制，表明 EGCG 可预防活性氧的直接损伤。对于Cr6+应激， Vc、EDTA 明显减轻细胞损伤，两者协同作用效果增强，可见直接清除活性氧及络合 Cr 各价离子都可预防和减轻细胞损伤。EGCG 既是高效的活性氧清除剂，也是天然的金属络合剂，EGCG对 Cr6+应激损伤的保护作用与 Vc 和 EDTA 的协同作用效果相当，这就表明 EGC
14、G 既通过直接清除活性氧预防 Cr 对 Vero 细胞的损害，还可通过络合 Cr 离子减少活性氧产生，从而有效地保护 Vero 细胞免受应激损伤。可见，抑制活性氧产生及其损伤是 EGCG 保护 Vero细胞的重要机制。活性氧是诱发肾病的重要因素。活性氧对肾组织的损伤由 Strok 等首先提出，目前已公认为引发肾病的重要机制，甚至是许多因子损伤肾组织的最终介质。研究表明，微摩尔浓度的H2O2 即可直接引起肾小球损害，导致肾小球通透性改变和肾血流动力学异常。活性氧引发肾脏病变，病变肾脏加剧活性氧的产生，形成恶性循环。既然 EGCG 可有效减少体外肾细胞的活性氧产生及其损伤，对体内肾细胞应有同样效果，这可能是茶多酚保护肾脏的重要途径，但确切的作用过程和靶位还有待进一步研究。
