1、作物遗传育种专业优秀论文 四个云南软米水稻品种低值链淀粉含量形成机制研究关键词：食味品质 稻米品质 低直链淀粉含量 Wx 基因摘要：本研究选用四个云南软米品种毫屁、毫皮、毫木细和毫安闷，探索其低直链淀粉含量形成机制，试图为优质软米分子育种提供理论依据。主要研究结果如下： 1根据水稻全基因组序列信息设计引物，利用 overlapping PCR方法，并对 PCR 产物直接测序，获得毫屁 Wx 约 7kb 的基因组序列，序列分析结果为：启动子具有 Wxlt;#39;agt;启动子的特点，即第一内含子 5端剪接位点为 AG/GT，可以被充分剪接，且该位点上游(CT)lt;,ngt;处有 10 个简单
2、重复，与稻米的高直链淀粉含量高度相关；编码区在第四外显子(+497 个)处存在一个单碱基突变(碱基 A 突变为 G)，编码子由 GAC 突变为 GGC，导致了天门冬氨酸突变为甘氨酸。与前人研究相比，毫屁中控制低直链淀粉含量的基因是一个新 Wx 复等位基因，命名为WXlt;#39;hpgt;。 根据第四外显子的单核苷酸突变位点设计 dCAPs 标记，利用该标记检测另外三个云南软米，毫皮、毫木细和毫安闷。这些品种的 Wx 基因在该位点的基因型和 Wxlt;#39;hpgt;相同。利用和毫屁相同的方法获得这些品种的 Wx 基因组序列，其 Wx 基因也都在第四外显子处存在一个单核苷酸突变，验证了 dC
3、APs 标记检测结果。 2分别提取毫屁、日本晴和南京 11 抽穗 14 天胚乳 GBSSI 进行 SDS-PAGE 分析。日本晴胚乳 GBSSI 积累量明显低于南京 11 胚乳 GBSSI 积累量，这与前人研究结果一致。另外，毫屁胚乳中 GBSSI 积累量和酶活性都显著低于日本晴，表明毫屁胚乳中积累较少 GBSSI 蛋白，并伴随着 GBSSI 活性减弱。 3分别提取毫屁、日本晴和南京 11 抽穗 14 天胚乳 RNA，用两对引物 primerRT-1 和 primerRT-2 作半定量 RT-PCR。毫屁、日本晴和南京 11 胚乳中 Wx 基因表达的前体 mRNA 量相同，其中 Wxlt;#3
4、9;hpgt;基因的转录本只形成一种 2.3kb 的成熟mRNA，表明其具有 Wxlt;#39;agt;启动子功能的特点。 另外，利用带有质粒 p1301：WXlt;#39;hpgt;和p1301：Wxlt;#39;bgt;的农杆菌转化水稻愈伤，潮霉素筛选一个月后获得抗性愈伤，分别检测 GUS 活性。Wxlt;#39;hpgt;启动子驱动的 GUS 活性显著高于 WXlt;#39;bgt;基因启动子驱动的 GUS 活性，表明 Wxlt;#39;hpgt;启动子具有较强的转录能力。 4对 Wxlt;#39;bgt;基因进行原核表达分析。提取水稻胚乳 RNA，利用 RT-PCR 方法得到 WXlt
5、;#39;hpgt;全长cDNA，将其构建到大肠杆菌表达载体 pET30a(+)中，转化 BL21，获得含有Wxlt;#39;hpgt;全长 cDNA 的重组工程菌。经包涵体蛋白变性和复性后，测定 pET：Wxlt;#39;hpgt;表达的融合蛋白催化活性。以 pET：Wxlt;#39;bgt;表达的融合蛋白活性为对照，两者的催化活性没有显著差异，表明 Wxlt;#39;hpgt;存在的一个单核苷酸突变没有影响到 Wxlt;#39;hpgt;蛋白活性。 5为了通过转基因技术验证 WXlt;#39;hpgt;中单核苷酸突变对该基因功能的影响，分别构建了 CaMV 35S 启动子驱动的WXlt;#
6、39;hpgt;全长 cDNA 正义表达载体pPZ：WXlt;#39;hpgt;和对照质粒pPZ：Wxlt;#39;bgt;，为进一步转化水稻的研究奠定基础。 6利用扫描电镜，对四个云南软米品种、日本晴和苏御糯成熟子粒胚乳淀粉粒的形态、大小和排列等形状进行了观察比较。结果表明：云南软米的超微观结构与日本晴和苏御糯有较大差别。日本晴淀粉颗粒结合紧密，淀粉粒呈明显的多面体结构；苏御糯淀粉粒颗粒分布比较疏松，淀粉粒结构呈球体结构；而云南软米淀粉颗粒的表面结构不规则，介于球状和多面体之间，并且淀粉颗粒上有微孔状结构。最后对云南软米的特殊淀粉粒结构与其直链淀粉含量的联系进行了讨论。正文内容本研究选用四个
7、云南软米品种毫屁、毫皮、毫木细和毫安闷，探索其低直链淀粉含量形成机制，试图为优质软米分子育种提供理论依据。主要研究结果如下： 1根据水稻全基因组序列信息设计引物，利用 overlapping PCR 方法，并对 PCR 产物直接测序，获得毫屁 Wx 约 7kb 的基因组序列，序列分析结果为：启动子具有 Wxlt;#39;agt;启动子的特点，即第一内含子5端剪接位点为 AG/GT，可以被充分剪接，且该位点上游(CT)lt;,ngt;处有 10 个简单重复，与稻米的高直链淀粉含量高度相关；编码区在第四外显子(+497 个)处存在一个单碱基突变(碱基 A 突变为 G)，编码子由 GAC 突变为 G
8、GC，导致了天门冬氨酸突变为甘氨酸。与前人研究相比，毫屁中控制低直链淀粉含量的基因是一个新 Wx 复等位基因，命名为WXlt;#39;hpgt;。 根据第四外显子的单核苷酸突变位点设计 dCAPs 标记，利用该标记检测另外三个云南软米，毫皮、毫木细和毫安闷。这些品种的 Wx 基因在该位点的基因型和 Wxlt;#39;hpgt;相同。利用和毫屁相同的方法获得这些品种的 Wx 基因组序列，其 Wx 基因也都在第四外显子处存在一个单核苷酸突变，验证了 dCAPs 标记检测结果。 2分别提取毫屁、日本晴和南京 11 抽穗 14 天胚乳 GBSSI 进行 SDS-PAGE 分析。日本晴胚乳 GBSSI
9、积累量明显低于南京 11 胚乳 GBSSI 积累量，这与前人研究结果一致。另外，毫屁胚乳中 GBSSI 积累量和酶活性都显著低于日本晴，表明毫屁胚乳中积累较少 GBSSI 蛋白，并伴随着 GBSSI 活性减弱。 3分别提取毫屁、日本晴和南京 11 抽穗 14 天胚乳 RNA，用两对引物 primerRT-1 和 primerRT-2 作半定量 RT-PCR。毫屁、日本晴和南京 11 胚乳中 Wx 基因表达的前体 mRNA 量相同，其中 Wxlt;#39;hpgt;基因的转录本只形成一种 2.3kb 的成熟mRNA，表明其具有 Wxlt;#39;agt;启动子功能的特点。 另外，利用带有质粒 p
10、1301：WXlt;#39;hpgt;和p1301：Wxlt;#39;bgt;的农杆菌转化水稻愈伤，潮霉素筛选一个月后获得抗性愈伤，分别检测 GUS 活性。Wxlt;#39;hpgt;启动子驱动的 GUS 活性显著高于 WXlt;#39;bgt;基因启动子驱动的 GUS 活性，表明 Wxlt;#39;hpgt;启动子具有较强的转录能力。 4对 Wxlt;#39;bgt;基因进行原核表达分析。提取水稻胚乳 RNA，利用 RT-PCR 方法得到 WXlt;#39;hpgt;全长cDNA，将其构建到大肠杆菌表达载体 pET30a(+)中，转化 BL21，获得含有Wxlt;#39;hpgt;全长 cD
11、NA 的重组工程菌。经包涵体蛋白变性和复性后，测定 pET：Wxlt;#39;hpgt;表达的融合蛋白催化活性。以 pET：Wxlt;#39;bgt;表达的融合蛋白活性为对照，两者的催化活性没有显著差异，表明 Wxlt;#39;hpgt;存在的一个单核苷酸突变没有影响到 Wxlt;#39;hpgt;蛋白活性。 5为了通过转基因技术验证 WXlt;#39;hpgt;中单核苷酸突变对该基因功能的影响，分别构建了 CaMV 35S 启动子驱动的WXlt;#39;hpgt;全长 cDNA 正义表达载体pPZ：WXlt;#39;hpgt;和对照质粒pPZ：Wxlt;#39;bgt;，为进一步转化水稻的研
12、究奠定基础。 6利用扫描电镜，对四个云南软米品种、日本晴和苏御糯成熟子粒胚乳淀粉粒的形态、大小和排列等形状进行了观察比较。结果表明：云南软米的超微观结构与日本晴和苏御糯有较大差别。日本晴淀粉颗粒结合紧密，淀粉粒呈明显的多面体结构；苏御糯淀粉粒颗粒分布比较疏松，淀粉粒结构呈球体结构；而云南软米淀粉颗粒的表面结构不规则，介于球状和多面体之间，并且淀粉颗粒上有微孔状结构。最后对云南软米的特殊淀粉粒结构与其直链淀粉含量的联系进行了讨论。本研究选用四个云南软米品种毫屁、毫皮、毫木细和毫安闷，探索其低直链淀粉含量形成机制，试图为优质软米分子育种提供理论依据。主要研究结果如下：1根据水稻全基因组序列信息设计
13、引物，利用 overlapping PCR 方法，并对 PCR 产物直接测序，获得毫屁 Wx 约 7kb 的基因组序列，序列分析结果为：启动子具有 Wxlt;#39;agt;启动子的特点，即第一内含子 5端剪接位点为 AG/GT，可以被充分剪接，且该位点上游(CT)lt;,ngt;处有 10 个简单重复，与稻米的高直链淀粉含量高度相关；编码区在第四外显子(+497 个)处存在一个单碱基突变(碱基 A 突变为 G)，编码子由 GAC 突变为GGC，导致了天门冬氨酸突变为甘氨酸。与前人研究相比，毫屁中控制低直链淀粉含量的基因是一个新 Wx 复等位基因，命名为WXlt;#39;hpgt;。 根据第四
14、外显子的单核苷酸突变位点设计 dCAPs 标记，利用该标记检测另外三个云南软米，毫皮、毫木细和毫安闷。这些品种的 Wx 基因在该位点的基因型和 Wxlt;#39;hpgt;相同。利用和毫屁相同的方法获得这些品种的 Wx 基因组序列，其 Wx 基因也都在第四外显子处存在一个单核苷酸突变，验证了 dCAPs 标记检测结果。 2分别提取毫屁、日本晴和南京 11 抽穗 14 天胚乳 GBSSI 进行 SDS-PAGE 分析。日本晴胚乳 GBSSI 积累量明显低于南京 11 胚乳 GBSSI 积累量，这与前人研究结果一致。另外，毫屁胚乳中 GBSSI 积累量和酶活性都显著低于日本晴，表明毫屁胚乳中积累较
15、少 GBSSI 蛋白，并伴随着 GBSSI 活性减弱。 3分别提取毫屁、日本晴和南京 11 抽穗 14 天胚乳 RNA，用两对引物 primerRT-1 和 primerRT-2 作半定量 RT-PCR。毫屁、日本晴和南京 11 胚乳中 Wx 基因表达的前体 mRNA 量相同，其中 Wxlt;#39;hpgt;基因的转录本只形成一种 2.3kb 的成熟mRNA，表明其具有 Wxlt;#39;agt;启动子功能的特点。 另外，利用带有质粒 p1301：WXlt;#39;hpgt;和p1301：Wxlt;#39;bgt;的农杆菌转化水稻愈伤，潮霉素筛选一个月后获得抗性愈伤，分别检测 GUS 活性。
16、Wxlt;#39;hpgt;启动子驱动的 GUS 活性显著高于 WXlt;#39;bgt;基因启动子驱动的 GUS 活性，表明 Wxlt;#39;hpgt;启动子具有较强的转录能力。 4对 Wxlt;#39;bgt;基因进行原核表达分析。提取水稻胚乳 RNA，利用 RT-PCR 方法得到 WXlt;#39;hpgt;全长cDNA，将其构建到大肠杆菌表达载体 pET30a(+)中，转化 BL21，获得含有Wxlt;#39;hpgt;全长 cDNA 的重组工程菌。经包涵体蛋白变性和复性后，测定 pET：Wxlt;#39;hpgt;表达的融合蛋白催化活性。以 pET：Wxlt;#39;bgt;表达的
17、融合蛋白活性为对照，两者的催化活性没有显著差异，表明 Wxlt;#39;hpgt;存在的一个单核苷酸突变没有影响到 Wxlt;#39;hpgt;蛋白活性。 5为了通过转基因技术验证 WXlt;#39;hpgt;中单核苷酸突变对该基因功能的影响，分别构建了 CaMV 35S 启动子驱动的WXlt;#39;hpgt;全长 cDNA 正义表达载体pPZ：WXlt;#39;hpgt;和对照质粒pPZ：Wxlt;#39;bgt;，为进一步转化水稻的研究奠定基础。 6利用扫描电镜，对四个云南软米品种、日本晴和苏御糯成熟子粒胚乳淀粉粒的形态、大小和排列等形状进行了观察比较。结果表明：云南软米的超微观结构与日
18、本晴和苏御糯有较大差别。日本晴淀粉颗粒结合紧密，淀粉粒呈明显的多面体结构；苏御糯淀粉粒颗粒分布比较疏松，淀粉粒结构呈球体结构；而云南软米淀粉颗粒的表面结构不规则，介于球状和多面体之间，并且淀粉颗粒上有微孔状结构。最后对云南软米的特殊淀粉粒结构与其直链淀粉含量的联系进行了讨论。本研究选用四个云南软米品种毫屁、毫皮、毫木细和毫安闷，探索其低直链淀粉含量形成机制，试图为优质软米分子育种提供理论依据。主要研究结果如下：1根据水稻全基因组序列信息设计引物，利用 overlapping PCR 方法，并对 PCR 产物直接测序，获得毫屁 Wx 约 7kb 的基因组序列，序列分析结果为：启动子具有 Wxlt
19、;#39;agt;启动子的特点，即第一内含子 5端剪接位点为 AG/GT，可以被充分剪接，且该位点上游(CT)lt;,ngt;处有 10 个简单重复，与稻米的高直链淀粉含量高度相关；编码区在第四外显子(+497 个)处存在一个单碱基突变(碱基 A 突变为 G)，编码子由 GAC 突变为GGC，导致了天门冬氨酸突变为甘氨酸。与前人研究相比，毫屁中控制低直链淀粉含量的基因是一个新 Wx 复等位基因，命名为WXlt;#39;hpgt;。 根据第四外显子的单核苷酸突变位点设计 dCAPs 标记，利用该标记检测另外三个云南软米，毫皮、毫木细和毫安闷。这些品种的 Wx 基因在该位点的基因型和 Wxlt;#
20、39;hpgt;相同。利用和毫屁相同的方法获得这些品种的 Wx 基因组序列，其 Wx 基因也都在第四外显子处存在一个单核苷酸突变，验证了 dCAPs 标记检测结果。 2分别提取毫屁、日本晴和南京 11 抽穗 14 天胚乳 GBSSI 进行 SDS-PAGE 分析。日本晴胚乳 GBSSI 积累量明显低于南京 11 胚乳 GBSSI 积累量，这与前人研究结果一致。另外，毫屁胚乳中 GBSSI 积累量和酶活性都显著低于日本晴，表明毫屁胚乳中积累较少 GBSSI 蛋白，并伴随着 GBSSI 活性减弱。 3分别提取毫屁、日本晴和南京 11 抽穗 14 天胚乳 RNA，用两对引物 primerRT-1 和
21、 primerRT-2 作半定量 RT-PCR。毫屁、日本晴和南京 11 胚乳中 Wx 基因表达的前体 mRNA 量相同，其中 Wxlt;#39;hpgt;基因的转录本只形成一种 2.3kb 的成熟mRNA，表明其具有 Wxlt;#39;agt;启动子功能的特点。 另外，利用带有质粒 p1301：WXlt;#39;hpgt;和p1301：Wxlt;#39;bgt;的农杆菌转化水稻愈伤，潮霉素筛选一个月后获得抗性愈伤，分别检测 GUS 活性。Wxlt;#39;hpgt;启动子驱动的 GUS 活性显著高于 WXlt;#39;bgt;基因启动子驱动的 GUS 活性，表明 Wxlt;#39;hpgt;
22、启动子具有较强的转录能力。 4对 Wxlt;#39;bgt;基因进行原核表达分析。提取水稻胚乳 RNA，利用 RT-PCR 方法得到 WXlt;#39;hpgt;全长cDNA，将其构建到大肠杆菌表达载体 pET30a(+)中，转化 BL21，获得含有Wxlt;#39;hpgt;全长 cDNA 的重组工程菌。经包涵体蛋白变性和复性后，测定 pET：Wxlt;#39;hpgt;表达的融合蛋白催化活性。以 pET：Wxlt;#39;bgt;表达的融合蛋白活性为对照，两者的催化活性没有显著差异，表明 Wxlt;#39;hpgt;存在的一个单核苷酸突变没有影响到 Wxlt;#39;hpgt;蛋白活性。
23、5为了通过转基因技术验证 WXlt;#39;hpgt;中单核苷酸突变对该基因功能的影响，分别构建了 CaMV 35S 启动子驱动的WXlt;#39;hpgt;全长 cDNA 正义表达载体pPZ：WXlt;#39;hpgt;和对照质粒pPZ：Wxlt;#39;bgt;，为进一步转化水稻的研究奠定基础。 6利用扫描电镜，对四个云南软米品种、日本晴和苏御糯成熟子粒胚乳淀粉粒的形态、大小和排列等形状进行了观察比较。结果表明：云南软米的超微观结构与日本晴和苏御糯有较大差别。日本晴淀粉颗粒结合紧密，淀粉粒呈明显的多面体结构；苏御糯淀粉粒颗粒分布比较疏松，淀粉粒结构呈球体结构；而云南软米淀粉颗粒的表面结构不
24、规则，介于球状和多面体之间，并且淀粉颗粒上有微孔状结构。最后对云南软米的特殊淀粉粒结构与其直链淀粉含量的联系进行了讨论。本研究选用四个云南软米品种毫屁、毫皮、毫木细和毫安闷，探索其低直链淀粉含量形成机制，试图为优质软米分子育种提供理论依据。主要研究结果如下：1根据水稻全基因组序列信息设计引物，利用 overlapping PCR 方法，并对 PCR 产物直接测序，获得毫屁 Wx 约 7kb 的基因组序列，序列分析结果为：启动子具有 Wxlt;#39;agt;启动子的特点，即第一内含子 5端剪接位点为 AG/GT，可以被充分剪接，且该位点上游(CT)lt;,ngt;处有 10 个简单重复，与稻米
25、的高直链淀粉含量高度相关；编码区在第四外显子(+497 个)处存在一个单碱基突变(碱基 A 突变为 G)，编码子由 GAC 突变为GGC，导致了天门冬氨酸突变为甘氨酸。与前人研究相比，毫屁中控制低直链淀粉含量的基因是一个新 Wx 复等位基因，命名为WXlt;#39;hpgt;。 根据第四外显子的单核苷酸突变位点设计 dCAPs 标记，利用该标记检测另外三个云南软米，毫皮、毫木细和毫安闷。这些品种的 Wx 基因在该位点的基因型和 Wxlt;#39;hpgt;相同。利用和毫屁相同的方法获得这些品种的 Wx 基因组序列，其 Wx 基因也都在第四外显子处存在一个单核苷酸突变，验证了 dCAPs 标记检
26、测结果。 2分别提取毫屁、日本晴和南京 11 抽穗 14 天胚乳 GBSSI 进行 SDS-PAGE 分析。日本晴胚乳 GBSSI 积累量明显低于南京 11 胚乳 GBSSI 积累量，这与前人研究结果一致。另外，毫屁胚乳中 GBSSI 积累量和酶活性都显著低于日本晴，表明毫屁胚乳中积累较少 GBSSI 蛋白，并伴随着 GBSSI 活性减弱。 3分别提取毫屁、日本晴和南京 11 抽穗 14 天胚乳 RNA，用两对引物 primerRT-1 和 primerRT-2 作半定量 RT-PCR。毫屁、日本晴和南京 11 胚乳中 Wx 基因表达的前体 mRNA 量相同，其中 Wxlt;#39;hpgt;
27、基因的转录本只形成一种 2.3kb 的成熟mRNA，表明其具有 Wxlt;#39;agt;启动子功能的特点。 另外，利用带有质粒 p1301：WXlt;#39;hpgt;和p1301：Wxlt;#39;bgt;的农杆菌转化水稻愈伤，潮霉素筛选一个月后获得抗性愈伤，分别检测 GUS 活性。Wxlt;#39;hpgt;启动子驱动的 GUS 活性显著高于 WXlt;#39;bgt;基因启动子驱动的 GUS 活性，表明 Wxlt;#39;hpgt;启动子具有较强的转录能力。 4对 Wxlt;#39;bgt;基因进行原核表达分析。提取水稻胚乳 RNA，利用 RT-PCR 方法得到 WXlt;#39;hp
28、gt;全长cDNA，将其构建到大肠杆菌表达载体 pET30a(+)中，转化 BL21，获得含有Wxlt;#39;hpgt;全长 cDNA 的重组工程菌。经包涵体蛋白变性和复性后，测定 pET：Wxlt;#39;hpgt;表达的融合蛋白催化活性。以 pET：Wxlt;#39;bgt;表达的融合蛋白活性为对照，两者的催化活性没有显著差异，表明 Wxlt;#39;hpgt;存在的一个单核苷酸突变没有影响到 Wxlt;#39;hpgt;蛋白活性。 5为了通过转基因技术验证 WXlt;#39;hpgt;中单核苷酸突变对该基因功能的影响，分别构建了 CaMV 35S 启动子驱动的WXlt;#39;hpgt
29、;全长 cDNA 正义表达载体pPZ：WXlt;#39;hpgt;和对照质粒pPZ：Wxlt;#39;bgt;，为进一步转化水稻的研究奠定基础。 6利用扫描电镜，对四个云南软米品种、日本晴和苏御糯成熟子粒胚乳淀粉粒的形态、大小和排列等形状进行了观察比较。结果表明：云南软米的超微观结构与日本晴和苏御糯有较大差别。日本晴淀粉颗粒结合紧密，淀粉粒呈明显的多面体结构；苏御糯淀粉粒颗粒分布比较疏松，淀粉粒结构呈球体结构；而云南软米淀粉颗粒的表面结构不规则，介于球状和多面体之间，并且淀粉颗粒上有微孔状结构。最后对云南软米的特殊淀粉粒结构与其直链淀粉含量的联系进行了讨论。本研究选用四个云南软米品种毫屁、毫皮
30、、毫木细和毫安闷，探索其低直链淀粉含量形成机制，试图为优质软米分子育种提供理论依据。主要研究结果如下：1根据水稻全基因组序列信息设计引物，利用 overlapping PCR 方法，并对 PCR 产物直接测序，获得毫屁 Wx 约 7kb 的基因组序列，序列分析结果为：启动子具有 Wxlt;#39;agt;启动子的特点，即第一内含子 5端剪接位点为 AG/GT，可以被充分剪接，且该位点上游(CT)lt;,ngt;处有 10 个简单重复，与稻米的高直链淀粉含量高度相关；编码区在第四外显子(+497 个)处存在一个单碱基突变(碱基 A 突变为 G)，编码子由 GAC 突变为GGC，导致了天门冬氨酸突
31、变为甘氨酸。与前人研究相比，毫屁中控制低直链淀粉含量的基因是一个新 Wx 复等位基因，命名为WXlt;#39;hpgt;。 根据第四外显子的单核苷酸突变位点设计 dCAPs 标记，利用该标记检测另外三个云南软米，毫皮、毫木细和毫安闷。这些品种的 Wx 基因在该位点的基因型和 Wxlt;#39;hpgt;相同。利用和毫屁相同的方法获得这些品种的 Wx 基因组序列，其 Wx 基因也都在第四外显子处存在一个单核苷酸突变，验证了 dCAPs 标记检测结果。 2分别提取毫屁、日本晴和南京 11 抽穗 14 天胚乳 GBSSI 进行 SDS-PAGE 分析。日本晴胚乳 GBSSI 积累量明显低于南京 11
32、 胚乳 GBSSI 积累量，这与前人研究结果一致。另外，毫屁胚乳中 GBSSI 积累量和酶活性都显著低于日本晴，表明毫屁胚乳中积累较少 GBSSI 蛋白，并伴随着 GBSSI 活性减弱。 3分别提取毫屁、日本晴和南京 11 抽穗 14 天胚乳 RNA，用两对引物 primerRT-1 和 primerRT-2 作半定量 RT-PCR。毫屁、日本晴和南京 11 胚乳中 Wx 基因表达的前体 mRNA 量相同，其中 Wxlt;#39;hpgt;基因的转录本只形成一种 2.3kb 的成熟mRNA，表明其具有 Wxlt;#39;agt;启动子功能的特点。 另外，利用带有质粒 p1301：WXlt;#3
33、9;hpgt;和p1301：Wxlt;#39;bgt;的农杆菌转化水稻愈伤，潮霉素筛选一个月后获得抗性愈伤，分别检测 GUS 活性。Wxlt;#39;hpgt;启动子驱动的 GUS 活性显著高于 WXlt;#39;bgt;基因启动子驱动的 GUS 活性，表明 Wxlt;#39;hpgt;启动子具有较强的转录能力。 4对 Wxlt;#39;bgt;基因进行原核表达分析。提取水稻胚乳 RNA，利用 RT-PCR 方法得到 WXlt;#39;hpgt;全长cDNA，将其构建到大肠杆菌表达载体 pET30a(+)中，转化 BL21，获得含有Wxlt;#39;hpgt;全长 cDNA 的重组工程菌。经包
34、涵体蛋白变性和复性后，测定 pET：Wxlt;#39;hpgt;表达的融合蛋白催化活性。以 pET：Wxlt;#39;bgt;表达的融合蛋白活性为对照，两者的催化活性没有显著差异，表明 Wxlt;#39;hpgt;存在的一个单核苷酸突变没有影响到 Wxlt;#39;hpgt;蛋白活性。 5为了通过转基因技术验证 WXlt;#39;hpgt;中单核苷酸突变对该基因功能的影响，分别构建了 CaMV 35S 启动子驱动的WXlt;#39;hpgt;全长 cDNA 正义表达载体pPZ：WXlt;#39;hpgt;和对照质粒pPZ：Wxlt;#39;bgt;，为进一步转化水稻的研究奠定基础。 6利用扫描
35、电镜，对四个云南软米品种、日本晴和苏御糯成熟子粒胚乳淀粉粒的形态、大小和排列等形状进行了观察比较。结果表明：云南软米的超微观结构与日本晴和苏御糯有较大差别。日本晴淀粉颗粒结合紧密，淀粉粒呈明显的多面体结构；苏御糯淀粉粒颗粒分布比较疏松，淀粉粒结构呈球体结构；而云南软米淀粉颗粒的表面结构不规则，介于球状和多面体之间，并且淀粉颗粒上有微孔状结构。最后对云南软米的特殊淀粉粒结构与其直链淀粉含量的联系进行了讨论。本研究选用四个云南软米品种毫屁、毫皮、毫木细和毫安闷，探索其低直链淀粉含量形成机制，试图为优质软米分子育种提供理论依据。主要研究结果如下：1根据水稻全基因组序列信息设计引物，利用 overla
36、pping PCR 方法，并对 PCR 产物直接测序，获得毫屁 Wx 约 7kb 的基因组序列，序列分析结果为：启动子具有 Wxlt;#39;agt;启动子的特点，即第一内含子 5端剪接位点为 AG/GT，可以被充分剪接，且该位点上游(CT)lt;,ngt;处有 10 个简单重复，与稻米的高直链淀粉含量高度相关；编码区在第四外显子(+497 个)处存在一个单碱基突变(碱基 A 突变为 G)，编码子由 GAC 突变为GGC，导致了天门冬氨酸突变为甘氨酸。与前人研究相比，毫屁中控制低直链淀粉含量的基因是一个新 Wx 复等位基因，命名为WXlt;#39;hpgt;。 根据第四外显子的单核苷酸突变位点
37、设计 dCAPs 标记，利用该标记检测另外三个云南软米，毫皮、毫木细和毫安闷。这些品种的 Wx 基因在该位点的基因型和 Wxlt;#39;hpgt;相同。利用和毫屁相同的方法获得这些品种的 Wx 基因组序列，其 Wx 基因也都在第四外显子处存在一个单核苷酸突变，验证了 dCAPs 标记检测结果。 2分别提取毫屁、日本晴和南京 11 抽穗 14 天胚乳 GBSSI 进行 SDS-PAGE 分析。日本晴胚乳 GBSSI 积累量明显低于南京 11 胚乳 GBSSI 积累量，这与前人研究结果一致。另外，毫屁胚乳中 GBSSI 积累量和酶活性都显著低于日本晴，表明毫屁胚乳中积累较少 GBSSI 蛋白，并
38、伴随着 GBSSI 活性减弱。 3分别提取毫屁、日本晴和南京 11 抽穗 14 天胚乳 RNA，用两对引物 primerRT-1 和 primerRT-2 作半定量 RT-PCR。毫屁、日本晴和南京 11 胚乳中 Wx 基因表达的前体 mRNA 量相同，其中 Wxlt;#39;hpgt;基因的转录本只形成一种 2.3kb 的成熟mRNA，表明其具有 Wxlt;#39;agt;启动子功能的特点。 另外，利用带有质粒 p1301：WXlt;#39;hpgt;和p1301：Wxlt;#39;bgt;的农杆菌转化水稻愈伤，潮霉素筛选一个月后获得抗性愈伤，分别检测 GUS 活性。Wxlt;#39;hpg
39、t;启动子驱动的 GUS 活性显著高于 WXlt;#39;bgt;基因启动子驱动的 GUS 活性，表明 Wxlt;#39;hpgt;启动子具有较强的转录能力。 4对 Wxlt;#39;bgt;基因进行原核表达分析。提取水稻胚乳 RNA，利用 RT-PCR 方法得到 WXlt;#39;hpgt;全长cDNA，将其构建到大肠杆菌表达载体 pET30a(+)中，转化 BL21，获得含有Wxlt;#39;hpgt;全长 cDNA 的重组工程菌。经包涵体蛋白变性和复性后，测定 pET：Wxlt;#39;hpgt;表达的融合蛋白催化活性。以 pET：Wxlt;#39;bgt;表达的融合蛋白活性为对照，两者
40、的催化活性没有显著差异，表明 Wxlt;#39;hpgt;存在的一个单核苷酸突变没有影响到 Wxlt;#39;hpgt;蛋白活性。 5为了通过转基因技术验证 WXlt;#39;hpgt;中单核苷酸突变对该基因功能的影响，分别构建了 CaMV 35S 启动子驱动的WXlt;#39;hpgt;全长 cDNA 正义表达载体pPZ：WXlt;#39;hpgt;和对照质粒pPZ：Wxlt;#39;bgt;，为进一步转化水稻的研究奠定基础。 6利用扫描电镜，对四个云南软米品种、日本晴和苏御糯成熟子粒胚乳淀粉粒的形态、大小和排列等形状进行了观察比较。结果表明：云南软米的超微观结构与日本晴和苏御糯有较大差别。
41、日本晴淀粉颗粒结合紧密，淀粉粒呈明显的多面体结构；苏御糯淀粉粒颗粒分布比较疏松，淀粉粒结构呈球体结构；而云南软米淀粉颗粒的表面结构不规则，介于球状和多面体之间，并且淀粉颗粒上有微孔状结构。最后对云南软米的特殊淀粉粒结构与其直链淀粉含量的联系进行了讨论。本研究选用四个云南软米品种毫屁、毫皮、毫木细和毫安闷，探索其低直链淀粉含量形成机制，试图为优质软米分子育种提供理论依据。主要研究结果如下：1根据水稻全基因组序列信息设计引物，利用 overlapping PCR 方法，并对 PCR 产物直接测序，获得毫屁 Wx 约 7kb 的基因组序列，序列分析结果为：启动子具有 Wxlt;#39;agt;启动子
42、的特点，即第一内含子 5端剪接位点为 AG/GT，可以被充分剪接，且该位点上游(CT)lt;,ngt;处有 10 个简单重复，与稻米的高直链淀粉含量高度相关；编码区在第四外显子(+497 个)处存在一个单碱基突变(碱基 A 突变为 G)，编码子由 GAC 突变为GGC，导致了天门冬氨酸突变为甘氨酸。与前人研究相比，毫屁中控制低直链淀粉含量的基因是一个新 Wx 复等位基因，命名为WXlt;#39;hpgt;。 根据第四外显子的单核苷酸突变位点设计 dCAPs 标记，利用该标记检测另外三个云南软米，毫皮、毫木细和毫安闷。这些品种的 Wx 基因在该位点的基因型和 Wxlt;#39;hpgt;相同。利
43、用和毫屁相同的方法获得这些品种的 Wx 基因组序列，其 Wx 基因也都在第四外显子处存在一个单核苷酸突变，验证了 dCAPs 标记检测结果。 2分别提取毫屁、日本晴和南京 11 抽穗 14 天胚乳 GBSSI 进行 SDS-PAGE 分析。日本晴胚乳 GBSSI 积累量明显低于南京 11 胚乳 GBSSI 积累量，这与前人研究结果一致。另外，毫屁胚乳中 GBSSI 积累量和酶活性都显著低于日本晴，表明毫屁胚乳中积累较少 GBSSI 蛋白，并伴随着 GBSSI 活性减弱。 3分别提取毫屁、日本晴和南京 11 抽穗 14 天胚乳 RNA，用两对引物 primerRT-1 和 primerRT-2
44、作半定量 RT-PCR。毫屁、日本晴和南京 11 胚乳中 Wx 基因表达的前体 mRNA 量相同，其中 Wxlt;#39;hpgt;基因的转录本只形成一种 2.3kb 的成熟mRNA，表明其具有 Wxlt;#39;agt;启动子功能的特点。 另外，利用带有质粒 p1301：WXlt;#39;hpgt;和p1301：Wxlt;#39;bgt;的农杆菌转化水稻愈伤，潮霉素筛选一个月后获得抗性愈伤，分别检测 GUS 活性。Wxlt;#39;hpgt;启动子驱动的 GUS 活性显著高于 WXlt;#39;bgt;基因启动子驱动的 GUS 活性，表明 Wxlt;#39;hpgt;启动子具有较强的转录能力
45、。 4对 Wxlt;#39;bgt;基因进行原核表达分析。提取水稻胚乳 RNA，利用 RT-PCR 方法得到 WXlt;#39;hpgt;全长cDNA，将其构建到大肠杆菌表达载体 pET30a(+)中，转化 BL21，获得含有Wxlt;#39;hpgt;全长 cDNA 的重组工程菌。经包涵体蛋白变性和复性后，测定 pET：Wxlt;#39;hpgt;表达的融合蛋白催化活性。以 pET：Wxlt;#39;bgt;表达的融合蛋白活性为对照，两者的催化活性没有显著差异，表明 Wxlt;#39;hpgt;存在的一个单核苷酸突变没有影响到 Wxlt;#39;hpgt;蛋白活性。 5为了通过转基因技术验证
46、 WXlt;#39;hpgt;中单核苷酸突变对该基因功能的影响，分别构建了 CaMV 35S 启动子驱动的WXlt;#39;hpgt;全长 cDNA 正义表达载体pPZ：WXlt;#39;hpgt;和对照质粒pPZ：Wxlt;#39;bgt;，为进一步转化水稻的研究奠定基础。 6利用扫描电镜，对四个云南软米品种、日本晴和苏御糯成熟子粒胚乳淀粉粒的形态、大小和排列等形状进行了观察比较。结果表明：云南软米的超微观结构与日本晴和苏御糯有较大差别。日本晴淀粉颗粒结合紧密，淀粉粒呈明显的多面体结构；苏御糯淀粉粒颗粒分布比较疏松，淀粉粒结构呈球体结构；而云南软米淀粉颗粒的表面结构不规则，介于球状和多面体之
47、间，并且淀粉颗粒上有微孔状结构。最后对云南软米的特殊淀粉粒结构与其直链淀粉含量的联系进行了讨论。本研究选用四个云南软米品种毫屁、毫皮、毫木细和毫安闷，探索其低直链淀粉含量形成机制，试图为优质软米分子育种提供理论依据。主要研究结果如下：1根据水稻全基因组序列信息设计引物，利用 overlapping PCR 方法，并对 PCR 产物直接测序，获得毫屁 Wx 约 7kb 的基因组序列，序列分析结果为：启动子具有 Wxlt;#39;agt;启动子的特点，即第一内含子 5端剪接位点为 AG/GT，可以被充分剪接，且该位点上游(CT)lt;,ngt;处有 10 个简单重复，与稻米的高直链淀粉含量高度相关
48、；编码区在第四外显子(+497 个)处存在一个单碱基突变(碱基 A 突变为 G)，编码子由 GAC 突变为GGC，导致了天门冬氨酸突变为甘氨酸。与前人研究相比，毫屁中控制低直链淀粉含量的基因是一个新 Wx 复等位基因，命名为WXlt;#39;hpgt;。 根据第四外显子的单核苷酸突变位点设计 dCAPs 标记，利用该标记检测另外三个云南软米，毫皮、毫木细和毫安闷。这些品种的 Wx 基因在该位点的基因型和 Wxlt;#39;hpgt;相同。利用和毫屁相同的方法获得这些品种的 Wx 基因组序列，其 Wx 基因也都在第四外显子处存在一个单核苷酸突变，验证了 dCAPs 标记检测结果。 2分别提取毫屁
49、、日本晴和南京 11 抽穗 14 天胚乳 GBSSI 进行 SDS-PAGE 分析。日本晴胚乳 GBSSI 积累量明显低于南京 11 胚乳 GBSSI 积累量，这与前人研究结果一致。另外，毫屁胚乳中 GBSSI 积累量和酶活性都显著低于日本晴，表明毫屁胚乳中积累较少 GBSSI 蛋白，并伴随着 GBSSI 活性减弱。 3分别提取毫屁、日本晴和南京 11 抽穗 14 天胚乳 RNA，用两对引物 primerRT-1 和 primerRT-2 作半定量 RT-PCR。毫屁、日本晴和南京 11 胚乳中 Wx 基因表达的前体 mRNA 量相同，其中 Wxlt;#39;hpgt;基因的转录本只形成一种 2.3kb 的成熟mRNA，表明其具有 Wxlt;#39;agt;启动子功能的特点。 另外，利用带有质粒 p1301：WXlt;#39;hpgt;和p1301：Wxlt;#39;bgt;的农杆菌转化水稻愈伤，潮霉素筛选一个月后获得抗性愈伤，分别检测 GUS 活性。Wxlt
