1、内蒙古科技大学本科生毕业论文论文题目：NF1-A Minigene 构建与鉴定学生姓名： 学 号：1168149122专 业：生物技术班 级：生技 2011指导老师： 副教授内蒙古科技大学本科生毕业论文NF1-A Minigene 构建与鉴定摘要人类 I 型神经纤维瘤病(Neurofibromatosis type I，NF1)是最常见常染色体的显性遗传性肿瘤疾病中的一种，其主要的发病机制为 NF1 基因的突变缺失。可变剪接剪接因子导致真核基因呈现复杂程度从而显示蛋白质拥有多样性。本论文主要论述了可变剪接的机理，NF1 基因的结构与功能，以及 NF1 前体 mRNA的编辑。本实验提取了人体外周
2、血基因组 DNA，设计了两对引物，利用 PCR方法扩增 NF1 基因并导入 pcDNA3.1 质粒载体从而构建了 NF1-A minigene 基因，为后续 NF1 的 mRNA 前体可变剪接以及调控 NF1 剪接因子的研究奠定了基础。关键词：可变剪接；NF1 基因；载体内蒙古科技大学本科生毕业论文IConstruction and Identification of NF1-A MinigeneAbstractNeurofibromatosis type 1 (NF1) is one of the most common heritable autosomal dominantdisorde
3、rs.Alternative splicing modulates the function of neurofibromin, the NF1 gene product, by inserting the in-frameexon 23a into the region of NF1 mRNA that encodes the GTPase-activating protein-related domain. This paper mainly discusses the mechanism of alternative splicing, the structure and functio
4、n of NF1 gene, which introduces the variable splicing of mRNA precursor NF1 and the splicing factor of NF1 variant splicing in the regulation of the variable splicing. The extraction of the human peripheral blood genomic DNA. PCR amplified the NF1 gene.NF1 gene and pcDNA3.1 carriers for enzyme linke
5、d construct the NF1-A minegene gene.This study laid a foundation for the following research on mRNA NF1 precursor and the regulation of NF1 splicing factor.Keywords: Alternative splicing ; NF1 gene ; Vactor内蒙古科技大学本科生毕业论文目录摘要 .IAbstract.II第一章 文献综述 .11.1 可变剪接的概述 .11.2 可变剪接的主要形式 .11.3 可变剪接的基本机制 .21.3.1
6、 剪接增强子与沉默子 .21.3.2 剪接体的组装 .41.4 可变剪接的生物学意义 .41.5 NF1 基因概述 .51.5.1 NF1 基因的结构 .51.5.2 NF1 基因的功能 .51.6 NF1 mRNA 编辑 .61.7 肿瘤抑制基因的前体 mRNA 可变剪接 .7第二章 引 言 .9第三章 实验材料 与方法 .113.1 实验材料 .113.1.1 材料处理 .113.1.2 实验主要化学试剂 .113.1.3 实验主要仪器 .123.1.4 试剂的配制 .123.1.5 琼脂糖凝胶电泳试剂的配制 .133.2 实验方法 .143.2.1 人类基因组 DNA 的提取 .14内蒙
7、古科技大学本科生毕业论文i3.2.2 NF1 基因的 PCR 扩增 .153.2.2.1 引物的设计 .153.2.2.2 PCR 反应体系（25 l ）的建立 .163.2.3 浓度的测定及电泳检测 .163.2.3.1 浓度的测定 .163.2.3.2 琼脂糖凝胶电泳 .173.2.4 PCR 产物的纯化 .173.2.5 pcDNA3.1 载体提取与转化 .183.2.5.1 pcDNA3.1 质粒的小量提取（碱裂解法） .183.2.5.2 pcDNA3.1 质粒载体图谱 .193.2.5.3 大肠杆菌 DH5感受态细胞的制备 .193.2.5.4 pcDNA3.1 载体转化大肠杆菌
8、DH5 .203.2.6 NF1-A Minigene 基因的构建 .203.2.6.1 NF1 基因与 pcDNA3.1 质粒载体双酶切 .203.2.6.2 双酶切产物的纯化 .213.2.6.3 酶连 .213.2.7 重组质粒的提取(试剂盒法) .223.2.8 菌落 PCR 的鉴定 .223.2.8.1 重组质粒的 PCR 扩增 .233.2.8.2 重组质粒的酶切 .23第四章 结果讨论与分析 .254.1 人类基因组的提取 .254.2 目的片段的扩增与纯化 .264.2.1 目的片段的扩增 .264.2.2 PCR 产物的纯化 .274.3 pcDNA3.1 载体的制备 .28
9、内蒙古科技大学本科生毕业论文ii4.3.1 大肠杆菌 DH5感受态细胞的制备 .284.3.2 pcDNA3.1 质粒的小量提取（碱裂解法） .284.4 NFI-A 基因目的片段和 pcDNA3.1 载体双酶切 .294.5 酶连 .304.6 重组质粒的鉴定 .31第五章 结论及后续研究展望 .325.1 结论 .325.2 后续研究与展望 .32参考文献 .34致谢 .39内蒙古科技大学本科生毕业论文0第一章 文献综述1.1 可变剪接的概述一些 mRNA 前体通过某种特异性的剪接方式而产生具有特异性的 mRNA剪接异构体被称为可变剪接，也叫选择性剪接（alternative splici
10、ng） 1。对于一些成熟的 mRNA 是通过真核细胞核内可变剪接的剪接因子利用 5端加帽、切除内含子、3末端加尾切割等一些基本的生物体加工，就形成了大家所共识的mRNA，这些物质从而可以参与选择性降解参与翻译同时形成复合物输出核外 2。我们所熟知的 mRNA 可变剪接包括外显子剪接，外显子跳跃，互斥可变外显子等，可以使 10000 多个外显子不同程度发生可变剪接，这些众多的外显子位于人体绝大部分细胞和组织块中，丰富了人体系统的多样性。已有实验研究表明，一些剪接因子从人体的生长发育方面进行一些控制调节并产生生物学受体多样性以及复杂性等方面起决定性作用 3。对于人类绝大部分可变剪接的基因他们一方面
11、表达与神经系统和免疫系统，另一方面则对转录调控以及信号转导所包括的突出兴奋性调节和离子通道动力学的调节 4。对于这些基因异常的可变剪接可导致特异性剪接型和神经胶质瘤系统功能的异常 mRNA 的异位表达 5。因此，此领域的研究越来越到人类的重视。1.2 可变剪接的主要形式对于可变剪接的研究，不同时期有不同的可变剪接类型，本轮为可变剪接的类型是综合了以往的剪接研究大致分为七种类型如下(如图 1.1 所示)，分别为内含子保留(a)、可变 5剪接位点(b)、可变 3剪接位点(c)、外显子跳过(d)、互斥可变外显子(e)、可变启动子 (f)和可变 poly(A)(g)6。内蒙古科技大学本科生毕业论文1图
12、 1.1 可变剪接的基本类型1.3 可变剪接的基本机制1.3.1 剪接增强子与沉默子mRNA 的剪接是由剪接体实现的。内含子边界序列在剪接体组装过程中进行识别。它的保守性序列位于内含子的 5 和 3边界，这段序列粘合度比较高 7。许多隐蔽的类似的边界序列常常位于剪接体的内部，从而使 mRNA 剪接有一套正确的机制来防范。目前已发现，顺式作用序列元件可以辅助真假剪接位点的识别 8 。这些顺式作用原件与 mRNA 前体组成多聚体，从而调节剪接体的组装 9 。要保持这种剪接的平衡必须需要外显子的保留和跳过这些竞争的协调作用 10。而这些调控元件其相对生物活性又由相应的因子包括剪接调控因子以及生物活性
13、因子的结合来决定。许多 ESEs 顺式作用元件其分子内包含 SRp 家族成员活性因子的结合位点 11。ESSs 和 ISSs 分布于相应的剪接因子序列中，与反式作用因子例如核内不均一核糖核蛋白（hnRNP）与 hnRNPs 等家族成员结合抑制剪接的发生 12。hnRNPs 包含 hnRNPA1、多聚嘧啶序列结合蛋白（PTBhnRNPI）、果蝇 SXL 基因等。由于反式作用因子不再与剪接因子协调作用反而抵抗剪接因子（如 snRNPs）结合到剪接识别位点，有的甚至是导致外显子环出，从而抑制剪接体的组装从而阻碍可变剪接的发生 13。我们以果蝇tra-mRNA 前体的可变剪接为例，对于雌性个体在 tr
14、a-mRNA 前体 SXL 蛋白处结合到上游 3剪接位点的多聚嘧啶结合位点不在进行前进这样便阻止了 U2AF的结合，抑制了该位点的剪接，前体 SXL 蛋白与其下游的 3剪接位点结合U2AF 而非我们正常认为的 SXL，所以该位点发生剪接。PTBhnRNPI 的剪接抑制作用则是通过与 AF 正向结合 14 。而相对于 hnRNPA1，它的的可变剪接调控作用是通过其与 U2AF 结合抑制 SRp 与剪接识别位点结合，这样双重作用内蒙古科技大学本科生毕业论文2使得剪接增强子与剪接沉默子在剪接体组装过程中发挥很重要的作用 15。图 1.2 顺势作用原件结合 mRNA 对可变剪接调控示意图注：各种剪接调
15、控因子结合在外显子和内含子中的调控元件上矩形框是外显子,波浪线是内含子。1.3.2 剪接体的组装剪接体的组装过程大致如下 16 ：首先是定型复合物（E complex）的形成，U1 snRNP 与 5剪接位点结合成二聚体并与 RNA-RNP 间的碱基配对，从而使SF1 剪接因子不再附着于分支点结合蛋白，而是分支点结合蛋白与 SF2 去结合，达到形成二聚体的效果。U2 snRNP 辅助因子小亚基（U2AF35）和 U2AF65 与U3AF65 分别与多嘧啶序列结合 C 从而反馈剪接体，使其独立完成与 U1 snRNP的组装。富含丝氨酸精氨酸蛋白（SRp）结合到外显子，首次完成 SRp 与 U4
16、snRNP 的复合，其次是 U2 snRNP 与分支点序列结合形成前剪接复合体（A complex），完成内含子的切除与外显子的连接，形成剪接体（B complex）17 。如图 1.2 所示：1.4 可变剪接的生物学意义可变剪接是一种高效率产生基因组复杂程度与蛋白质功能多样性的生物学机制。这种高频率、高丰度的生物学机制产生种属特异性剪接产物，可能不会对一些组织和细胞功能产生很大的影响，但是从理论角度更可能是保持特异基因的活性使基因呈现出高表达的状态，从而丰富了蛋白质组其在生物界功能的复杂性和其相对功能的多样性。同时，一些生物学家利用测序和微阵列分析的统计结果不同程度表明，在具有不同细胞分化类
17、型切其蛋白功能复杂的组织块，如大脑、睾丸、乳腺，或者在经过自然选择的压力下需提供生物学竞争机制不同功能的组织或者个体细胞，例如人类免疫系统中，这些组织块和细胞上的正内蒙古科技大学本科生毕业论文3常的基因更易发生剪接体组装从而发生可变剪接，那么它们就会利用有限的基因，从而去满足机体系统功能多样性以及适应性的需求 18。例如，果蝇的雌性受体内 mRNA 的互调，可变互斥外显子等一些家族受体 唐氏综合征细胞黏附分子参与其吞噬功能 19。而对于一些我们常见的高等生物，其体内的转录产物前体 mRNA 可变剪接是一种相对于低等生物十分普遍的生物自然现象。当然了，其实并非我们所想象，具有编码功能与生物学活性
18、功能的物质均为所有的可变剪接产生的。举个例子，与人类基因类似的大鼠，它的已知序列的基因组转录产物中，并不是像其他生物，它的转录物质就约三分之一的剪接产物不再产生蛋白质功能多样性而是引入前移的终止密码子（PTCs），从而不再翻译。大鼠体内的 NMD 这种生物分子则可能是一种监控可变剪接以及诱导剪接因子包括剪接增强子与沉默子失活而发生错误的机制 20。1.5 NF1 基因概述1.5.1 NF1 基因的结构I 型神经纤维瘤病(neurofibromatosis type I, NF1)是最常见的显性遗传性疾病中的一种，影响着世界上 1/3000 的人口，它的临床特征表现不一 21。20 世纪90 年
19、代年前后发现一种基因在这种病人中缺失，即所谓的 NF1 基因。现在对NF1 基因结构、产物及功能还有很多不清楚的地方，但对它的研究已经越来越受到重视，进展很快。NF1 基因大约 30kb，位于染色体 17q11.2 区域，转录产物约 11-13kb。NF1基因位点的突变率为 10-4，相对于一般单位点基因的突变率高约 10 倍，自发突变率非常高，而 30%-50%的情况下都是新的突变，仅基因大小是不能解释 NF1基因这种高突变率现象的，就基因大小来说比一般基因的突变率最多高出 10 倍，而实际上高出 100 倍，现在还没有资料能表明基因中存在有突变热点 22。对于NF1 基因中内含子与外显子之间界限的确切位置正在研究，但通过基因组
