1、本 科 学 生 毕 业 论 文2012 年 5 月 3 日论文题目： 白羽肉鸡多器官亚细胞结构研究学 院： 生命科学学院年 级： 2008 级专 业： 生物工程姓 名： 吴俊生学 号： 20084568指导教师： 李文辉摘要本研究以农业部“948”项目引进的法国罗斯 308 隐性白羽鸡为素材，运用 TEM 技术，测定了白羽肉鸡八个器官（心、肝、肺、皮、腿部肌肉、大肠、小肠、胃）细胞内细胞核、线粒体、内质网、核糖体及高尔基体在胞内的分布情况。研究白羽肉鸡机体内细胞核、线粒体、内质网、核糖体及高尔基体在不同器官细胞内的分布情况，探讨其对机体用药和疫苗使用的细胞层次机制合理性具有重要的参考价值。关键
2、词白羽肉鸡；组织包埋；切片染色；线粒体；细胞核；内质网；TEM 技术IAbstractIn this study, “948“ project of the Ministry of Agriculture to introduce the French Rose 308 Recessive White chicken material, the use of TEM techniques, determination of the white feather chicken eight organs (heart, liver, lung, skin, leg muscle, large in
3、testine, small intestine, stomach) within the cell nucleus, mitochondria, endoplasmic reticulum, ribosomes and Golgi apparatus in the intracellular distribution of The distribution of the white feather chicken machine body of the nucleus, mitochondria, endoplasmic reticulum, ribosomes and Golgi appa
4、ratus in cells of different organs to explore the reasonableness of its body medicine and vaccines used in the cell-level mechanism has important reference value.Key wordsWhite feather chicken; Tissue embedding; Section staining; Mitochondria; Ribosomes ;Endoplasmic reticulum; The TEM technology目录摘要
5、 .IAbstract .II1. 前言 .11.1 白羽肉鸡概述 .11.2 白羽肉鸡疾病现状 .21.3 禽类疾病与亚细胞结构 .21.4 透射电子显微镜概述 .31.4.1 透射电子显微镜成像原理 .31.4.2 TEM 制样技术 .42. 材料与方法 .62.1 实验材料 .62.2 实验器材及试剂 .62.3 实验方法 .63. 结果与分析 .93.1 透射电镜图 .93.2 观察结果 .94. 结论或讨论 .11参考文献 .12附录一 .13附录二 .14致谢 .15白羽肉鸡多器官亚细胞结构研究01. 前言三十年来，我国经过大力发展白羽肉鸡产业，已成为世界三大肉鸡生产国之一。但白羽
6、肉鸡的疾病问题依然非常严重。本研究以农业部“948”项目引进的法国罗斯308 隐性白羽鸡为素材，运用 TEM 技术，测定了白羽肉鸡八个部位（心、肝、肺、皮、腿部肌肉、大肠、小肠、胃）细胞内线粒体、内质网、核糖体及高尔基体在胞内的分布数量和大小。实验活鸡取材，获取鸡的 8 种样本材料。依次进行组织固定、脱水、包埋、切片等程序。大多数药物通过作用于受体而发挥药理作用，而酶是药物作用的主要靶标（作用部位） ，通过抑制酶活性或激活酶活性而发挥药理作用，多数酶的本质是蛋白质，其中内质网、核糖体和高尔基体是蛋白质合成与运输过程中的重要细胞器。线粒体除了作为细胞内能量生成的关键细胞器外,还与细胞凋亡、脂质代
7、谢、自由基生成等重要生化过程密切相关。近年来随着对线粒体结构和功能的深入研究,发现线粒体是多类药物的细胞内作用靶点,与相关药物之间存在广泛而复杂的相互作用 1，线粒体、内质网等细胞器在机体内的分布直接影响到有关药物的作用效果。研究白羽肉鸡机体内细胞核、线粒体、内质网、核糖体及高尔基体在不同器官的分布情况对机体的合理使用药物和疫苗具有重要的参考价值。1.1 白 羽 肉 鸡 概 述白羽肉鸡属原鸡雉科有 39 对染色体，该品种由美国爱拔益加家禽育种公司育成，四系配套杂交，白羽。此品种的特点是体型大，生长发育快，饲料转化率高，适应性强。因其育成历史较长，肉用性能优良，为我国肉鸡生产的主要鸡种。我国白羽
8、肉鸡养殖产业,从上世纪八十年代开始,经过近 30 年的努力,已成为我国农业产业化发展最迅速、规模化最强，最典型的行业。最近 20 年来,白羽肉鸡产量更是以年平均 5%-6%的速度持续增长。 但是，中国作为一个养殖业高速发展的发展中国家，其家禽的饲养管理水平较低下，疾病防控能力更显不足；在白羽肉鸡流行性疾病的管控方面出现的问题非常突出。据统计，我国因疾病损失占肉鸡总产量的 20 2 。由此，生产成本的提高、出口的限制和公共卫生的安全都成了制约这一行业进一步发展的“短板” 。白羽肉鸡多器官亚细胞结构研究11.2 白 羽 肉 鸡 疾 病 现 状我国幅员辽阔，生物多样，流动性居世界之首，其肉鸡疫病类别
9、繁多。又由于中国是历史悠久的农业古国，人类的发展与迁移历史造成养殖环境很复杂。近三十年来，由于生物制品行业的快速壮大，疫苗厂家如雨后春笋、层出不穷；进而造成疫苗种类众多。在免疫选择压力下，很多病毒迅速发生变异；又因不同品种鸡的免疫水平不一致，导致很多疫病在流行病学、临床症状及病理变化中呈现非典型化，如多次在世界范围爆发的禽流感。常见的约 10 种细菌可使肉鸡发病，它们是：大肠杆菌、沙门菌、葡萄球菌、绿脓杆菌、曲霉菌等。细菌耐药性严重，多重耐用菌株多，药物残留问题都给养殖者造成很大困扰 3。另外，很多细菌病为人畜共患病，这就给食品安全和公共卫生带来严重隐患。肉鸡生长速度快，代谢旺盛，需氧量大，极
10、易发生呼吸道疾病。致病微生物感染，不良气候条件，营养缺乏，有害气体中毒甚至免疫接种都可以引起呼吸道疾病发生，某些肉鸡群死淘率可达 30，损失严重。常见病原体包括：新城疫病毒、鸡毒支原体、大肠杆菌、传染性喉气管炎病毒等 4。它们存在明显的协同致病作用，特别是当鸡群中存在大肠杆菌和鸡毒支原体感染，接种新城疫和传染性法氏囊病时会出现比较严重的发病情况。病毒性免疫抑制病普遍存在于肉鸡群中，常见的有传染性法氏囊病、传染性贫血病、马立克氏病和禽淋巴白血病等。1.3 禽 类 疾 病 与 亚 细 胞 结 构自进入 21 世纪后，禽流感在全球愈演愈烈，呈现世界性流行趋势。据世界卫生组织（WHO）报道，截止 20
11、11 年 4 月，全球人类感染 H5N1 亚型流感病毒的 539 个病例中已有 318 人死亡，病死率达到 60%。禽流感不仅给养禽业造成了巨大的损失，而且严重威胁到人类健康和安全。1992 年以来，H9N2 亚型禽流感在国内时有流行和散发，已对中国的养禽业造成严重损失 5。在鸡群中免疫抑制作用会增加鸡体对病毒性和细菌性疾病的易感性 6，也有数据显示低致病性禽流感感染鸡群时出现的临床症状和严重程度与病毒毒株及共感染的免疫抑制类疾病密切相关 7-8。禽流感（Avian Influenza，AI）是由型流感病毒（Avian Influenza 白羽肉鸡多器官亚细胞结构研究2Virus，AIV）引起
12、的从呼吸系统病变到全身败血症的一种高度接触性急性传染病，已导致家禽及鸟类的普遍感染并对人类造成了严重的威胁 9。目前，在亚细胞水平的研究结果表明：NS1 蛋白（Nonsreuctural Protein 1，NS1）是 A 型流感病毒惟一的非结构蛋白，由第 8 个基因编码，可编码 202 个237个氨基酸（Amino Acid，AA） ，在调节流感病毒的致病性及毒力方面发挥着重要的作用，它可能是 H5N1 亚型禽流感病毒高致死率的关键所在 10。在朱春玉等研究禽流感病毒NS1 蛋白亚细胞定位中显示 NS1 蛋白在细胞核内呈聚集趋势 11。1.4 透 射 电 子 显 微 镜 概 述显微镜都是被人
13、们用来观察人肉眼不能识别清楚的微小物体，将其放大成像的光学器材。由于分辨能力的缘故，亚显微及超微结构必须应用电子显微镜才能达到清楚观察的目的。1665 年复合显微镜和 1937 年透射式电子显微镜诞生。自 1932 年德国柏林大学E.Ruska 等人制造的第一台实用电子显微镜，到高性能多功能电子显微镜的普遍使用，为亚细胞结构的研究开创了新阶段。1953 年瑞典人制造出优质的超薄切片机，和随后出现的各种电子染色方法，使超薄切片技术的得到成熟和完善；也迅速推动了电子显微镜技术在生物学领域中的广泛应用。目前，生物电子显微镜技术已由细胞水平发展到分子水平和原子水平的结构测定上。英国医学委员会分子生物学
14、实验室的 A.Klug 博士将高分辨电子显微镜技术应用于生物大分子的结构测定上，由于他在核酸-蛋白质复合体的晶体结构研究方面作出的卓越贡献，荣获了 1982 年诺贝尔化学奖。1.4.1 透射电子显微镜成像原理普通光学显微镜是用可见光作光源，照射到样品上，然后收集处理所得到的光信号，形成放大像。电子显微镜则是用一束具有较高能量的电子，代替可见光照射到样品上，然后收集处理所得到的信号，形成放大像。电子束在通过电磁场(电磁透镜)时发生曲折，与可见光在通过玻璃透镜时遵守同样的几何光学定律。分辨率与所用光源的波长有密切关系。电子束的波长远远小于可见光，所以它的分辨能力也就远远高于后者。这就是所有电子显微
15、镜(不论是透射的还是扫描的电子显微镜)与光学显微镜的白羽肉鸡多器官亚细胞结构研究3主要区别。现代透射电镜整体包括：电子光学系统、真空系统、电气系统、水冷却循环系统和压缩空气系统等。显微镜主体是电子光学系统，即镜筒。考虑到机械稳定性，真空度易保性，电镜镜筒都制成直立式的，自下而上由一个个电磁透镜垒起来。目前，比较主流的透射镜筒是 6-8 级成像透镜、电子枪室和观察室等组成，如本研究采用的日立-H7650。阴极灯丝在加热电流作用下发射电子束，该电子束在阳极加速器下加速向下高速运动，途经第一、二聚光镜的会聚作用让电子束聚焦在样品表面，电子束透过样品后，再通过物镜、第一、二中间镜和投影镜，四级放大后成
16、像于荧光屏上。这四级放大透镜各级放大倍数的乘积就是电镜总的放大倍数，因此透射电镜有着更高的放大范围（2000x-1000000x） 。1.4.2 TEM 制样技术在透射电镜生物样品的制备技术中，超薄切片技术是最关键的一环。目前应用的冷冻切片技术，电镜细胞化学技术、以及电镜放射自显影技术等都是以超薄切片技术为基础的。 TEM 在现代生物医学研究中起着越来越重要的作用,是研究超微结构的重要手段。因生物医学研究种类的繁多和样品制作的特殊性，使得制作过程繁多而复杂,也对样品的取材、固定、脱水、包埋和切片等一系列程序提出了严格的要求 12。目前，本实验室透射电镜样品的制备的过程包括组织的固定和包埋、玻璃
17、刀的制作、包埋块的修正、切片、半薄切片的染色、超薄切片的染色。而 TEM 技术中提到的“超薄切片” ， 是指使用超薄切片机切割已经过树脂包埋过的样品，且保证厚度在 0.1nm 以下的切片。切片的质量要确保薄而均匀，片子没有皱折、无钻石刀碎裂刀痕、震颤等缺陷。尤其在制作过程的各个环节，要力求细胞微结构保存良好，无人为假象。染色要深浅适宜，避免沉淀与污染且具有良好的反衬度。1.组织的固定和包埋生物样本在离开活体的正常环境之后,其组织结构在自溶酶作用下会迅速发生各种“死后”变化。为了保持细胞结构的活体状态,组织必须从活体取得后，在最短时间内投入固定液,一般不超过 1 分钟。本实验室采用戊二醛及锇酸双
18、固定法。固定的目的在于使离体组织尽量保持原有的形态结构。组织包埋是电镜制样过程的重要环节。白羽肉鸡多器官亚细胞结构研究42.玻璃刀的制作切片刀的好坏是决定超薄切片质量的重要器材。50 年代开始使用玻璃刀，因其锋利，制作方便，且价格便宜，被普遍采用。玻璃刀可用手工或制刀机制作。3.包埋块的修正聚合好的包埋块，在制片前，用刀片修成适当的大小和便于切片的金字塔形状，并使其中的组织块准确露出表面。必须除去组织周围多余的包埋介质或无关的部分。4.切片及切片的染色生物样品的超薄切片，反差很弱，在电镜下无法看清细胞结构，必须进行提高反差的处理，这种提高反差的办法通称“电子染色” 。染色经常在置于铜网上的超薄
19、切片上进行。一般都是用重金属盐柠檬酸铅和醋酸双氧铀进行染色。白羽肉鸡多器官亚细胞结构研究52.材料与方法2.1 实 验 材 料实验于 4 月 12 号在黑龙江大学农学楼 605 室，对 3 月龄白羽肉鸡活体取鲜活样本，包括心脏、肺、胃、大肠、小肠、皮肤、腿肌和肝脏。2.2 实 验 器 材 及 试 剂手术刀、眼科剪、眼科镊、离心管、培养皿、解剖台、分析天平、精密酸度计、移液枪、容量瓶、双面刀片、载玻片、玻璃棒、烧杯、量筒、干燥箱、包埋模板、牙签、试剂瓶、切片机（Leica EM UC6） 、制刀机（Leica EM KMR 2） 、透射电子显微镜（日立-H7650） 、玻璃刀、带膜载网、钟表镊子
20、、滤纸、 胶头滴管、蜡纸、1%饿酸固定液、2.5%戊二醛、PH6.8 磷酸缓冲液、蒸馏水、95%酒精、纯酒精、环氧丙烷、环氧树脂Epon812、MNA（甲基内次甲基四氢苯二甲酸酐） 、DDSA（十二烷基琥玻酸酐）和DMP-30（2,4,6-二甲氨基甲基苯酚） 、天青、中性品红、醋酸铀、柠檬酸铅、硝酸铅、氢氧化钠。2.3 实 验 方 法1.先对活鸡进行清理除污，用医用酒精对手术刀、眼科镊等器具擦拭，之后活体宰杀。2.白 羽 鸡 的 八 个 器 官 （ 心 、 肝 、 肺 、 皮 、 腿 部 肌 肉 、 大 肠 、 小 肠 、 胃 ） 进 行 组织 鲜 活 取 样 。3.即时将取下的组织放进装有 PH 6.8 磷酸缓冲液的培养皿中。 4.及时从刚获取的八个组织块上分别取下 1mm3小块，取材后快速放入预冷的磷酸缓冲液配制的 2.5%戊二醛固定液（04）中固定 2 小时，后更换固定液。继续固定样品 72 小时。5.用 PH6.8 磷酸缓冲液漂洗样品，每次 10min，共计 3 次；（这是避免戊二醛与锇酸发生氧化还原反应，生成沉淀。 ）6.1%饿酸固定液固定 24h（04） 。7.用 PH6.8 磷酸缓冲液漂洗样品，每次 10min，共计 3 次。
