1、RNA干扰 RNA interference，RNAi,生物技术史上革命性事件,概述,RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。,如果将其作为一门生物技术，则定义为 ： RNAi是指体外人工合成的或体内的双链RNA（dsRNA）在细胞内特异性的将与之同源的 mRNA降解成21nt23nt 的小片段，使相应的基因沉默。 RNAi是将与靶基因的mRNA 同源互补的双链RNA(dsRNA ) 导入细胞,能特异性地降解该mRNA ,从而产生相应的功能表
2、型缺失, 属于转录后水平的基因沉默(post - transcriptional gene silence , PTGS)。,发现过程,共抑制现象的发现 RNAi研究的早期线索来自于美国和荷兰的两个转基因植物实验组,约根森（Jorgensen）研究小组 ,在对矮牵牛(petunias)进行的研究中有个奇怪的发现:他们设想将更多的色素基因注入矮脚牵牛植物体中，试图加深花朵的紫颜色，而结果出其预料，转基因的植株不仅没有新基因表达，反而使原有的色素基因也受到了抑制。,加入 chalcone synthase基因,or,转基因,发现过程,Jorgensen 将这种现象命名为共抑制(cosuppress
3、ion)因为导入的基因和其相似的内源基因同时都被抑制。,发现过程,Quelling现象并非只有植物学家才注意到了这种意外的现象。 1994年意大利的Cogoni等,将外源类胡萝卜素基因导入链孢霉(Neurosporacrassa),结果转化细胞中内源性的类胡萝卜素基因也受到了抑制。而在真菌转基因实验中这种共抑制现象被称 “quelling”（基因压制）现象。,发现过程,95年康乃尔大学的研究人员Guo(郭苏)和kemphues在秀丽线虫(C.elegans)中用反义RNA 阻止一些基因的表达，给对照组用正义RNA不但不增加该基因的表达，反而产生与反义RNA 同样的结果特异性阻断该基因的表达，这
4、个奇怪的现象直到3年后1998才被解开。1998年Fire等发现将ds RNA注入秀丽线虫可显著抑制特定基因的表达，并证明了Guo和kemphues所发现的正义RNA的基因压制作用其实是转录时污染微量dsRNA所造成的。,线虫体内的RNAi,线虫中RNAi效应的检测 （左面）两条线虫表现为绿色荧光蛋白（GFP）表达类型品系，该品系含有一个普遍性表达的GFP报告基因重组质粒（带有核内定位信号位点）。 （右面）喂食表达针对GFP的dsRNA的细菌后，整个虫体的GFP信号消失。,发现过程,将制备的RNA高度纯化后发现，正义RNA无基因抑制作用，反义RNA的基因抑制作用也很微弱，而用纯化后的dsRNA
5、注入线虫，却能高效、特异地阻断相应基因的表达。 实验证明双链RNA抑制基因的表达的效率比纯化后的反义RNA至少高几个数量 ，他们称此现象为ds RNA介导的RNA干扰（RNAi）。,Effects of mex-3 RNA interference on levels of the endogenous mRNA. Nomarski DIC micrographs show in situ hybridization of 4-cell stage embryos. (A) Negative control showing lack of staining in the absence of
6、the hybridization probe. (B) Embryo from uninjected parent showing normal pattern of endogenous mex-3 RNA (purple staining). (C) Embryo from parent injected with purified mex-3 antisense RNA. These embryos (and the parent animals) retain mex-3 mRNA, although levels may be somewhat less than wild typ
7、e. (D) Late 4-cell stage embryo from a parent injected with dsRNA corresponding to mex-3 ; no mex-3 RNA is detected. (Templates used for interfering RNA and in situ probes were largely non-overlapping.),RNA干扰的发现,安德鲁菲尔(AndrewZ.Fire)、克雷格梅洛(Craig C.Mello) 1998年发现了RNA干扰和基因沉默现象。其论文发表在1998年的NATRUE杂志上。,Fir
8、e A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 1998 Feb 19;391(6669):806-811.,发现过程,RNAi现象的普遍性随后陆续发现RNAi也存在于水稻、烟草、果蝇、小鼠及人等几乎所有的真核生物中。RNAi能高效特异的阻断基因的表达，在线虫，果蝇体内，RNAi能达到基因敲除的效果。,2006年10月2日瑞典皇家科
9、学院诺贝尔奖委员会宣布，将2006年度诺贝尔生理学或医学奖授予两名美国科学安德鲁法尔和克雷格梅洛，以表彰他们发现了RNA干扰现象。法尔和梅洛将分享一千万瑞典克朗的奖金(137万美元)。,RNA干扰获得诺贝尔生理学或医学奖,安德鲁菲尔(AndrewZ.Fire) 克雷格梅洛(Craig C.Mello)麻省理工 大学 哈弗大学,目前普遍认为，共抑制、基因压制和RNAi很可能具有相同的分子机制，都是通过dsRNA的介导而特异地降解靶mRNA, 抑制相应基因的表达。 实际上，法尔在接受诺贝尔奖网站采访时提到，第一个在线虫中观察到(RNA干扰)这种特别现象的是康奈尔大学研究生郭苏。 1995年，从复旦
10、大学毕业后赴美的郭苏在坎菲斯(Kenneth Kemphues)指导下，试图阻断秀丽新小杆线虫的某个基因时，意外地发现反义和正义这两种单链RNA都阻断了该基因的表达。,但可惜的是，她和坎菲斯一直没能解释这个奇怪现象。直到3年后，当时在卡内基研究所供职的法尔和梅洛才揭开了谜底：在郭苏的实验中，体外转录所得RNA污染了微量的双链RNA，而经过纯化的双链RNA能够高效率地阻断相应基因的表达。这就是RNA干扰。 郭苏目前在旧金山加州大学任职。她说：“他们在我们工作的基础上，解释了我们那个让人迷惑的现象，是一个飞跃我和坎菲斯通过话，我们的工作在这个奖项中有所贡献，我们为此感到自豪，也都认为安德鲁法尔和克
11、雷格理应获奖。”,在实验时，要认真观察每个现象，发现怀疑并给予证明，不要被误导。,正如美国西北大学神经生物学教授饶毅所说：“法尔的发现打开了一个新的研究领域，它既是一项科学发现，也是一项技术发明，为治疗人类许多疾病提供了新的希望，这项成就和两位华人很有关系，其中一位就是法尔实验室的研究技术员徐思群”。,毕业于上海第二医科大学的徐思群是那篇自然论文的第二作者。自1992年起，从美国拿到硕士学位的他在法尔实验室以研究技术员身份工作了6年。但他扮演的角色不只是通常意义上负责实验室日常运作的“管家”。 “一个科学实验成功的关键是实验设计和实验结果的分析理解，这当然要归功于安迪和克雷格。我经常说我是小人
12、，因为小人动手，君子动口和动脑，我不过是把他们的实验意图比较完整地在实验台上体现出来。”徐思群说。,法尔和梅洛等人的研究发表以后，激发了全球研究人员对RNA干扰领域的兴趣。2001年和2002年，美国科学杂志连续将RNA干扰列入年度十大科学进展 。,转录水平的基因沉默(Transcriptional Gene Silencing, TGS) 转录后水平的基因沉默(Post-transcriptional Gene Silencing, PTGS),TGS是指转基因在细胞核内RNA 合成受到了阻止而导致基因沉默。 PTGS 则是指转基因能够在细胞核里被稳定地转录，但在细胞质里却无相应的mRNA
13、存在这一现象。,基因沉默,RNA干扰的分子机制,基因沉默,RNA干扰的分子机制,dsRNA的产生: 内源性: 包括细胞内源性基因的双向表达; 具有反向重复序列的细胞内源性基因表达产生的短发夹RNA (short hairpin RNA， shRN A)等,外源性: 以转基因表达的mRNA 为模板，通过异常聚合作用形成dsRNA; 真核生物基因组中的转座子在复制表达过程 中产生的dsRNA; RNA病毒基因组或病毒感染复制过程中产生的dsRNA中间产物; 采 用化学合成的dsRNA;或用质粒或病毒载体表达所需的dsRNA等,siRNA制备方法,化学合成 体外转录法合成siRNA siRNA表达载
14、体 siRNA表达框架,siRNA设计的原则,siRNA双链设计时，一般在靶mRNA起始密码下游100200 bp至翻译终止密码上游50100 bp的范围内搜寻AA序列，并记录每个AA 3 端相邻19个核苷酸作为候选siRNA靶位点。,建议设计的siRNA不要针对mRNA的5 和3 端非编码区(untranslated regions，UTRs)，因为这些区域有丰富的调控蛋白结合位点，而UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP(siRNA protein complex，核酸内切酶复合物)结合mRNA，从而影响siRNA干扰的效果 。 最后还应将候选siRNA序列在GenBank进
15、行BLAST检索，与非同源基因具有3个或3个以上碱基相异的序列方可选用。,化学合成,早期RNAi实验中，dsRNA或siRNA均由化学法所合成。化学合成的siRNA纯度高，合成量不受限制，且还可对siRNA进行标记，方便对其跟踪，但该方法价格昂贵，不适用于siRNA序列的筛选和长期基因沉默实验。,体外转录法合成siRNA较为经济。根据siRNA序列合成相应DNA Oligo模板，再利用T7 RNA聚合酶进行体外转录，分别获得siRNA的正义链和反义链，然后将其退火、纯化即可得到能直接导入细胞的siRNA。 体外转录法最大缺点是siRNA合成量受限制，不过其价格较低，毒性小，稳定性好，效率高。,
16、体外转录法合成siRNA,Construction of siRNA by T7 RNA polymerase-mediated in vitro transcription.,siRNA表达载体,体外合成siRNA，不宜进行长期基因沉默研究。借助表达质粒或病毒载体在细胞内产生siRNA，使研究者无需直接操作RNA就可达到长期抑制靶基因表达的目的，且载体上的抗性标记有助于快速筛选出阳性克隆，这将具有更为广阔的应用前景。,短发夹RNA (shRNA),shRNA表达质粒多采用RNA聚合酶 启动子 (pol)。pol 在哺乳动物细胞内引导非编码小RNA的转录，转录产物无poly(A)尾，且在转录过
17、程中遇到连续45个U时转录终止。 此载体最后转录出的产物是经折叠形成的发夹状小RNA (small hairpin RNA，shRNA)；shRNA在细胞内被Dicer酶切割成3 端带有两个U突出的siRNA，进而启动RNAi，介导基因沉默。载体中的间隔序列为9个核苷酸时最为有效。,(A) U6 or H1 PolIII promoters drive the expression of a hairpin structure in which the sense and antisense strands of the siRNAare connected by a loop sequenc
18、e.,(B) Two U6- or H1-based expression cassettes are used to drive the separate transcription of the sense and antisense strands in the cell. The two strands would then anneal to form a double-stranded siRNA. An oligo-U overhang is present on each strand.,(C) A PolII promoter (a shortened version of
19、the human CMV) drives the expression of a hairpin siRNA. The transcript includes extra nucleotides at its 5 end and a poly-A tail (instead of an oligo-U) overhang at the 3 end.,用病毒载体介导RNAi近年来受到人们重点关注。利用病毒载体可以解决质粒转染效率低、效果不稳定且某些类型细胞不能转染等问题，从而扩大RNAi应用范围。常见病毒载体有腺病毒(Adenovirus)载体、逆转录病毒(Retrovirus)载体、慢病毒
20、(Lentivirus)载体等。,RNAi 的机制,dsRNA被加工成小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）。,dsRNA是RNAi的初始诱导因子， 但是dsRNA必须被Dicer酶进一步加工成长度为21 - 23个核苷酸的siRNA才能产生RNAi反 应。 Dicer酶属RNase家族中的第二类： 两个RNase结构域 一个dsRNA结合结构域( dsRNA-binding domain， dsRBD) ， 一个解旋酶结构域(helicase domain) 一个PAZ结构域,体外实验表明，人重组Dicer酶对dsRNA切割时，PAZ结构域绑定dsRNA的末端
21、，dsRNA结合结构域绑定dsRNA 内部，随后通过两个RNase结构域对dsRNA的双链分别进行切割成 长度约22个核昔酸的siRNA片段 。,siRNA片段带有5端磷酸基团，在其 3端有2个突出的核苷酸,RISC装载siRNA,装载siRNA的RISC ( RNA - induced silencing complex. RISC) 被称为RNA诱导的沉默复合物，由多种蛋白组成，其中关键成分是具核击内切酶活性的Argonaut2 ( Ago2 )蛋白。 siRNA 在ATP参与下被RNA解旋酶解旋成单链，并由其中反义链指导形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencin
22、g complex，RISC)。RISC由siRNA、解旋酶、ATP、核酸内切酶、核酸外切酶等多种成分组成。,RNAi 的机制,RISC/siRNA复合物中，siRNA是以单链形式存在，这说明在RISC装配的过程中或之后，siRNA发生解链，被选择与RISC进行装配的是双链siRNA中的引导链 (guide strand) ，该链将引导RISC寻找与之匹配的mRNA并进行剪切，而siRNA中的另一条链称为过客链(passenger strand) ，它从RISC复合物中游离出去，并可能被Ago2所剪切。,RISC剪切mRNA,RISC装载siRNA的引导链而处于激活状态，寻找和识别与之匹配的m
23、RNA，对mRNA进行剪切，这一过程与前面提及的对siRNA过客链的剪切过程类似。,RISC剪切mRNA可可以重复使用；RISC剪切mRNA位点一般处于siRNA的5端数起的第11个到第12个碱基相对应的位置。 剪切过程不依赖于ATP的，但是有ATP存在的情况下，ATP可能促 进RISC对mRNA剪切后产物的释放，或使RISC回复构象准备第二次剪切，,RNAi的机制,RNAi的放大效应机制,siRNA不仅可引导RISC切割靶RNA，而且可作为引物在RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)作用下以靶mRNA为模板合成新的dsRNA。 新合成的长链dsRNA同样可被RNase样核酸酶切割、降解而生成大
24、量的次级siRNA。次级siRNA又可进入合成-切割的循环过程，进一步放大RNAi作用。这种合成-切割的循环过程称为随机降解性PCR（random degradative PCR）。,Gisela Storz, Science, 296(5571):1263-1265, 2002.,RNAi 的特点,RNAi 的特点,RNA i应用,1. RNA干扰介导的细胞发育调控,线虫中调节幼虫发育的Lin14 基因受到Lin4基因控制。Lin4基因转录物经Dicer酶切割后产生一种由22个核苷酸组成的miRNA，然后该miRNA可以和Lin14 mRNA3 端非翻译区中存在的7个重复序 列互补配对，导致
25、该mRNA的降解。 人类细胞中存在几百种不同的miRNA，它们形成了一个十分复杂的调控网络，在发育时间调控、造血细胞分 化、细胞繁殖、细胞凋亡、组织发育等过程中扮演重要的角色。 果蝇中也发现miRNA调控一套特殊的基因，使其在细胞发育过程中适时表达,2. RNA干扰和病毒防御,RNA沉默是植物和无脊椎动物主要的病毒防御机制； 病毒本身既是 RNA干扰的诱导物，又是RNA干扰的攻击目标； 病毒为了抵抗RNA干扰的攻击，普遍编码了RNA干扰的抑制蛋白 。 迄今为止未发现在病毒感染哺乳动物细胞过程中能自然诱发有效的防御病毒的RNA干扰反应。,基因治疗：,在利用RNAi技术对HIV、乙型肝炎、丙型肝炎
26、等进行基因治疗研究中发现，选择病毒基因组中与人类基因组无同源性的序列作为抑制序列可在抑制病毒复制的同时避免对正常组织的毒副作用。 同时将抑制序列选择在特定的位点，可对部分有明确基因突变的恶性肿瘤细胞产生凋亡诱导作用以及抑制MDR 基因。 科学家们已经应用RNA干扰技术，在多种不同的动物疾病模型中获得了良好疗效。目前，6种基于该技术的药物已经在美国进入II期临床试验。,RNAi在探索基因功能中的应用：,在RNAi技术出现以前，基因敲除（gene knockout）是主要的反向遗传学（reverse genetics）研究手段，但其技术难度较高、操作复杂、周期长。由于RNAi技术可以利用siRNA
27、或siRNA表达载体快速、经济、简便的以序列特异方式剔除目的基因表达，所以现在已经成为探索基因功能的重要研究手段。同时siRNA表达文库构建方法的建立，使得利用RNAi技术进行高通量筛选成为可能，对阐明信号转导通路、发现新的药物作用靶点有重要意义。,总 述,植物、动物、人类都存在RNA干扰现象，RNA干扰已经作为一种强大的“基因沉默”技术而出现。 RNAi技术与基因组学、蛋白质组学和功能蛋白质组学密切相关，因此， RNAi本身可作为一项实验技术为生物工程及制药业等相关行业服务，从而在更深更广的领域发挥其作用。 动物实验已证明，可以通过RNAi的方法使导致血胆固醇升高的基因“沉默”；病毒性疾病，
28、眼疾，心血管代谢性疾病等方面的临床试验也正在进行中；这一方法为病毒性肝炎、艾滋病和肿瘤等人类顽疾的治疗指了一条新路 。,RNA干 扰的治疗技术正在进入人体试验阶段，不过还有一些难题有待解决: 如何在生物体内 实现有效的组织特异性的siRNA转染; 如何降低这种疗法对目的基因以外的其他基 因的影响，从而避免产生副作用; 如何实现RNA干扰效应在细胞与细胞、组织与组织 间的系统性扩散等。,反义核酸及药物,一、反义核酸概述：反义核酸（antisense nucleic acid）是指与体内某RNA或DNA序列具有互补顺序并能通过碱基配对与互补链杂交从而影响其目的基因表达的RNA或DNA片段。反义核酸
29、与目的基因结合后，通过位阻效应或诱导RNAase活性的降解作用，在复制、转录、剪接、mRNA转运及翻译等水平上，抑制或封闭目的（靶）基因的表达。,反义核酸也称反义寡核苷酸，最初是指与单链RNA互补的一段寡核苷酸序列。,反义抑制机理：目前普遍认为反义核酸可以在复制、转录、表达3个水平上发挥作用。其机制为： 在细胞核内以碱基配对原理与基因组DNA 结合，从复制与转录水平发挥反义阻止作用,这种反义技术称为“反基因治疗”(Anti-genetherapy); 与引物结合,从而在复制水平上阻止基因表达; 与mRNA 的5末端的SD(Shine-Dalgarno)序列或核糖体结合位点结合,阻碍核糖体的结合
30、,从而阻碍翻译,或使反义RNA 与mRNA 形成双链,以被水解酶水解;,(4)与mRNA 的SD 序列上游的非编码区结合，改变mRNA 的二级结构，从而阻碍核糖体的结合; (5)与mRNA 的5末端编码区(主要是起始密码AUG) 结 合，阻止RNA 的翻译; (6)作用于mRNA 的poly A 形成位点， 阻止成熟和转运; (7)作用于mRNAR 的5末端，阻止帽子结构的形成; (8)结合到前体RNA的外显子和内含子的连接区,阻止其剪切成熟;,二、反义核酸技术与药物 反义核酸技术是指根据碱基互补原理，用人工合成或生物体合成的特定互补的DNA或RNA片段（或其化学修饰产物）抑制或封闭目的基因表
31、达的技术。它包括反义RNA、反义DNA和肽核酸三大技术。第一代反义寡核苷酸药物硫代修饰寡聚核苷酸； 第二代反义寡核苷酸药物甲氧/乙氧基反义寡核苷酸 第三代反义寡核苷酸药物肽核酸。,（一）反义DNA,是人工合成的能与特定 DNA 或 RNA 互补结合的短核酸片段，从而在 DNA 或 RNA 水平上抑制特定基因的转录和翻译。,反义DNA分类及特点：,1、正常DNA片段（N-ODN）：人工合成，无修饰,2、甲基磷酸型DNA片段（M-ODN）：人工合成，甲基取代DNA片段磷上的羟基。 这种衍生物使DNA变成中性大分子，易被细胞吞饮进入细胞，而不被细胞内核酸酶降解。,3、硫代磷酸型DNA片段（S-ODN
32、）：DNA片段磷上的羟基被-SH取代，仍带负电荷，各种性质与正常DNA片段很相似。通过受体作用完整进入细胞，抗核酸酶能力强。可激活RNAaseH，降价RNA。,4、双硫代磷酸型DNA片段（SS-ODN）：在S-ODN的基础上，用-SH取代磷位上未参与形成二酯键的另一个氧，形成双硫代磷酸二酯键。SS-ODN抑制核酸酶的能力更强，但毒性加大。,5、-构型DNA片段：上述四种均为-构型。-型没有化学修饰，抗核酸酶降解的能力很强。与mRNA结合能力强于-DNA，一般以mRNA为靶标。,6、各种反义DNA片段的末端化学修饰。,（二）反义RNA,概念：是指核苷酸序列与其所调控的RNA序列互补的RNA片段。
33、,第二代反义寡核苷酸药物：甲氧/乙氧基反义寡核苷酸是一类RNA，即在RNA核糖环上的2 -羟基转化为甲氧基/乙氧基。,优点：可以口服，与RNA结合力强，无异构体，稳定性较好，硫相关毒性较小。 缺点：不能激活体内的RNase H,反义RNA作用机制 直接作用于靶 mRNA 的核蛋白体结合位点或与靶 mRNA 直接结合形成双链 RNA 结合非编码区 作用于基因的启动子,（三）肽核酸(peptide nucleic acid, PNA),概念：是指在特定肽链上连接不同碱基的核酸。即：以类氨基多肽链（N-氨基乙烷基乙酸链）代替核酸中的磷酸戊糖骨架，并按一定序列结合上标准的A、G、C、T碱基，从而形成肽核酸 第三代反义寡核苷酸药物。,作用：肽核酸可与互补DNA或RNA特异性结合， 抑制或封闭基因表达。,特点：与靶基因结合能力强，稳定性好，易吸收， 在体内具有内切酶活性和抑制端粒作用。,三、反义核酸的应用,1、基因功能分析：不需改变基因结构,2、在细胞或亚细胞水平上对基因表达进行定位 或定量研究：用标记的反义RNA或反义寡脱氧 核苷酸作为探针进行原位杂交。,3、基因治疗：是目前最有吸引力的手段之一。如：特异抑制癌基因或原癌基因,4、研究病毒致病机制：用反义RNA作探针。,
