1、RNAI 技术及其应用提要：RNA 干扰(RNA interference ,RNAi) 现象是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制。将与靶基因的转录产物 mRNA 存在同源互补序列的双链 RNA(double strand RNA ,dsRNA) 导入细胞后, 能特异性地降解该 mRNA ,从而产生相应的功能表型缺失,这一过程属于转录后基因沉默机制( posttranscriptional gene siliencing , PTGS) 范畴。RNAi 广泛存在于生物界,从低等原核生物 ,到植物,真菌, 无脊椎动物 ,甚至近来在哺乳动物中也发现了此种现象,只是机制也更为复杂。R
2、NA 干涉(RNAi)是近年发展起来的一种阻抑基因表达的新方法，该技术通过双链 RNA的介导，可以特异性地阻断或降低相应基因的表达。在肿瘤研究中，通过 RNAi 技术可以选择性地抑制人类肿瘤相关基因的表达，从而抑制肿瘤细胞的生长。该技术的应用为癌症的基因治疗提供了新的方法。癌基因的激活认为是肿瘤发生的根本原因之一，各种癌基因都可以成为肿瘤基因治疗的靶点。利用基因家族中多个基因具有同一段同源性很高的保守序列这一特性,针对这一区段序列设计相应的 siRNA，通过体外合成或构建在体内表达 siRNA 的载体的方法转入细胞中，可以特异性的封闭这些基因的转录产物而不影响其他基因的表达。作用机制：RNAi
3、 的作用机制.RNAi 的第一步是,dsRNA（双链 RNA） 在内切核酸酶(一种具有 RNase 样活性的核酸酶，称为 Dicer.) 作用下加工裂解形成 2125 nt （核苷酸）的由正义和反义序列组成的干扰性小 dsRNA ,即 siRNA。果蝇中 RNase III 样核酸酶 Dicer 含有解旋酶(helicase) 活性以及 dsRNA 结合域和 PAZ 结构域. 已发现在哺乳动物中也存在 Dicer 同类物.近年来研究发现,干扰性小 RNA(siRNA) 是 RNA 干扰作用(RNAi) 赖以发生的重要中间效应分子. siRNA 是一类特殊双链 RNA(dsRNA) 分子,具有特
4、征性结构 ,即 siRNA 的序列与所作用的靶 mRNA 序列具有同源性; siRNA 两条单链末端为 5端磷酸和 3端羟基. 此外,每条单链的 3端均有 23 个突出的非配对的碱基。细胞中 dsRNA 的形成是 RNAi 的第一步. 获得 dsRNA. 主要有三种途径：一：细胞内产生的 mRNA 在 RNA 聚合酶的作用下，依一条单链的 RNA 合成一条双链RNA；二：体外人工合成，原理类似于上；三：有一些长的 RNA 具有反向互补序列，它会自己和自己互补，产生一个茎环结构，这个结构很容易被核酸内切酶识别，但是核算内切酶只降解单链部分，互补的双链 RNA 被留下来。在线虫( C. elega
5、ns) 可以直接注射 dsRNA 或把线虫浸泡在含 dsRNA 溶液中等方式引入外源 dsRNA ,还可以通过喂养表达正义和反义 RNA 的细菌RNAi 的第二步是, siRNA 与特定的酶结合形成 RNA 诱导的沉默复合物 RISC(由 siRNA 中的反义链指导形成) ，RISC 复合物中含 siRNA、核酸内切酶、核酸外切酶以及解旋酶同源 RNA 链搜索活性等，其中的 siRNA 解链成为单链，由其中的反义链识别与其同源的靶 mRNA，并与靶 mRNA配对结合，在 mRNA 的近中点位置将靶 mRNA 切割，并由 RISC 中的酶把靶 mRNA 降解，从而阻断了 mRNA 传递遗传信息的
6、功能。siRNA 可作为一种特殊引物,在 RNA 依赖 RNA 聚合酶(RdRp) 作用下以靶 mRNA 为模板合成 dsRNA ,后者可被降解形成新的 siRNA ;新生成的 siRNA 又可进入上述循环. 这种过程称为随机降解性多聚酶链反应(random degradative PCR) . 新生的 dsRNA 反复合成和降解,不断产生新的 siRNA ,从而使靶 mRNA 渐进性减少,呈现基因沉默现象. RdRp 一般只对所表达的靶 mRNA 发挥作用, 这种在 RNAi 过程中对靶 mRNA 的特异性扩增作用有助于增强 RNAi 的特异性基因监视功能. 每个细胞只需要少量 dsRNA
7、即能完全关闭相应基因表达,可见 RNAi 过程具有生物催化反应的基本动力学特征.（在植物和线虫中存在的信号放大过程，但是在哺乳动物中不存在这种现象,可能与在哺乳动物体中 siRNA 不能作为 RdR 的引物有关 。 ）此外，：解开 siRNA 的双链后，反义 RNA 链能作为双链 RNA 合成的一个引物，以mRNA 为模板， (RNA dependentRNA polymerases，RdRPs ，又称作 RDRs)的作用下形成新的 dsRNA，并再次被 Dicer 识别并切断后形成新的 siRNA，这种新产生的 siRNA(次级siRNA,secondary siRNA)又可形成更多的 RI
8、SC 复合物并作用于 mRNA，使 mRNA 降解。因此小剂量的 dsRNA 即可诱导强大的 PTGS，即 PTGS 具有类似于激素作用或 PCR 那样的级联放大效应。最新的研究进一步揭示,ATP 在 siRNA 介导的 RNAi 中具有重要作用. 较长 dsRNA 向 siRNA 的转变要有 ATP 参与. siRNA 与蛋白因子形成一个无活性的约 360 kD 的蛋白PRNA 复合体 ;随之, siRNA 双链结构解旋并形成有活性的蛋白 PRNA 复合体(RISC) ,此步具有 ATP 依赖性 . RISC 活性复合体对靶 mRNA 的识别和切割作用,这一步可能不需 ATP 参与. 此外,
9、ATP 使 siRNA 5端带上磷酸分子,且对 siRNA 的功能具有重要作用. 上述过程中 siRNA 双链结构解旋很可能是一种稳定的结构改变 ,因为 siRNA 双链体与细胞裂解物、ATP 等孵育后再除去 ATP 及其它辅助因子,含有 siRNA 的活性复合体仍能识别和切割靶 mRNA 分子引自 Gregory J.Hannon(2002) Nature,418,244-2512 RNAi 的分子抑制机制2.1 转录抑制与 RNAi 有关的 dsRNA 及蛋白质可参与染色质的修饰作用，使其中的组蛋白和 DNA发生甲基化作用，使相应基因不能被转录，从而导致受阻基因不能表达。这种在转录水平上阻
10、断基因功能，使基因沉默的 RNAi 方式被称为转录基因沉默(Transcriptional gene silencing,TGS)。这种现象先在植物中得到证实,但是在哺乳动物中是否存在仍有争议。2004年 Svoboda 等研究表明，在小鼠卵母细胞中，通过 RNAi 引起靶基因表达沉默的长 dsRNA不能引起相应 DNA 区域从头合成 DNA 的甲基化。Morris 等也于同年得出实验结论，针对内源基因启动子的 siRNA 能够引起其区域内 CG 岛以及组蛋白 H3K9 的甲基化，从而在转录水平抑制基因的表达。2.2 转录后抑制不同来源的 dsRNA 通过各种转基因技术转入植物、线虫或哺乳动物
11、细胞内， 、被切割产生 siRNA 片断，再由合成的 RISC 切割靶 mRNA 从而阻断基因表达。这种基因能正常转录成 mRNA，但 mRNA 因被降解使基因功能被阻断，这种 RNAi 方式叫做转录后沉默(Post transcriptional gene silencing,PTGS)。siRNA 对靶 mRNA 降解具有序列特异性，只能引起同源 mRNA 降解，如果 siRNA 与mRNA 有一个 bp 不配对，RNAi 作用就极大降低，如果两者有 4 个 bp 不配对，就不能产生 RNAi。2.3 翻译抑制在细胞中存在内源性小片段单链 RNA(ssRNA)，其长度也在 2125 nt
12、之间，这种ssRNA 可与 mRNA 的 3非翻译区(3UTR) 特异性地结合，从而抑制 mRNA 的翻译和相应的功能蛋白质合成。这种小片段的 ssRNA 叫做 stRNA(small temporal RNA)。ssRNA 的形成是因为当 RNA 的大小为 7080 nt 时，容易形成双链的茎环状结构，其双链茎的长度正好在 2125 nt 之间，这样的双链结构易被 Dicer 酶识别并切割成 stRNA，由 stRNA 抑制翻译。这种方式的 RNAi 也作用于转录后形成的 mRNA，它在调节生物细胞内基因的表达、自身的发育方面起着重要的作用。MicroRNAs（miRNAs）是在真核生物中发
13、现的一类内源性的具有调控功能的非编码 RNA，其大小长约 2025 个核苷酸。成熟的 miRNAs 是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，随后组装进 RNA 诱导的沉默复合体，通过碱基互补配对的方式识别靶 mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶 mRNA 或者阻遏靶 mRNA 的翻译。最近的研究表 miRNA 参与各种各样的调节途径，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等等。miRNA 与 siRNA 的区别：（1） miRNA 是单链的，而 siRNA 则是双链的；（2） miRNA 参与正常情况下生长发育基因调控，而 siRNA 不
14、参与动物体的正常生长，只有在病毒或其它 dsRNA 诱导情况下才产生 siRNA,作为 miRNA 的完善和补充；（3） miRNA 在转录后水平调节基因表达，推测在翻译水平也起作用，而 siRNA 为转录后水平调节基因表达调控；（4） Dicer 酶对两类 RNA 的加工过程，miRNA 为不对称性，仅来自含茎环结构 RNA前体的一侧臂，剩余部分很快降解，而这种不对称性不存在于而 siRNA 加工过程中。.设计流程 ： 1. 目的基因的确定（1）、检索文献获取有实验证明有效的靶点序列（核对）（2）、http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/（3）、http:/ or http:/
15、2、设计 siRNA 序列在制备 siRNA 前都需要单独设计 siRNA 序列。研究发现对哺乳动物细胞，最有效的 siRNAs 是 21-23 个碱基大小、3端有两个突出碱基的双链RNA。siRNA 的序列专一性要求非常严谨，与靶 mRNA 之间一个碱基错配都会显著削弱基因沉默的效果。 （1）、选择 siRNA 靶位点：从转录 AUG 起始密码子开始，搜寻下游 AA 序列，记录跟每个 AA 3端相邻的 19 个核苷酸作为候选的 siRNA 靶位点。有研究结果显示 GC 含量在30%50%左右的 siRNA 要比那些 GC 含量偏高的更为有效。 Tuschl 等建议在设计 siRNA 时不要针
16、对 5和 3端的非编码区（untranslated regions，UTRs)，原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些 UTR 结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响 siRNP 核酸内切酶复合物结 合 mRNA 从而影响 siRNA 的效果。 （2）、序列同源性分析:将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列/EST 同源的序列。例如使用 BLAST（ www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）选出合适的目标序列进行合成。并非所有符合条件的 siRNA 都一样有效，其原因还不清楚，可能是位置效应的结果，因此对于一个目的基因，
17、一般要选择 3-5 个靶位点来设计 siRNA。通常来说，每个目标序列设计 34 对 siRNAs，选择最有效的进行后续研究。（3）siRNA 表达框架是一种由 PCR 反应得到能在细胞内表达 siRNA 的 DNA 模板，其结构为RNA pol III 启动子-表达 siRNA 的发夹状结构序列 RNA pol III，所获得的 PCR 产物可直接导入细胞。该方法最为简易省时，适用于筛选 siRNA及在不同宿主细胞中转录启动子与 siRNA 靶序列的最佳组合。（4）实验对照设置：实验对照是衡量 RNAi.实验数据可信度的一个重要因素。设立阳性对照目的是通过检测不同浓度的 siRNA 转染效率
18、及其最终干扰效果，来确定合适的转染条件和最低有效的 SIRNA 浓度。3、RNAi 表达载体的选用 化学合成与体外转录方法都是在体外得到 siRNA 后再导入细胞内，但是这两种方法主要有两方面无法克服的缺点：siRNA 进入细胞后容易被降解；进入细胞 siRNA 在细胞内的 RNAi 效应持续时间短。针对这种情况，出现了质粒、病毒类载体介导的 siRNA 体内表达。该方法的基本思路是：将 siRNA 对应的 DNA 双链模板序列克隆入载体的 RNA 聚合酶III 的启动子后，这样就能在体内表达所需的 siRNA 分子。这种方法总体的优点在于不需要直接操作 RNA，能达到较长时间的基因沉默效果。
19、 此外，带有抗生素标记的 siRNA 表达载体可用于长期抑制研究，通过抗性辅助筛选，该质粒可以在细胞中持续抑制靶基因的表达数星期甚至更久。同时RNAi-Ready 表达载体还能与逆转录病毒和腺病毒表达系统整合（BD Knockout RNAi Systems），大大提高 siRNA 表达载体对宿主细胞的侵染性，彻底克服某些细胞转染效率低的障碍，是实现哺乳动物细胞 siRNAs 瞬时表达与稳定表 达的理想工具。4、合成 DNA 模板 连接转化获得产物合成编码 shRNA 的 DNA 模板的两条单链，模板链后面接有 RNA PolyIII聚合酶转录中止位点，同时两端分别设计 BamH I 和 Hi
20、nd III 酶切位点，可以克隆到 siRNA 载体多克隆位点的 BamH I 和 Hind III 酶切位点之间。95，5min，缓慢退火， DNA 单链得到 shRNA 的 DNA 双链模板5、连接与转化基本步骤：（1）将 100l 感受态细胞于冰上解冻。（2）取 5l 连接产物加入到感受态细胞中，轻轻旋转几次以混匀内容物。在冰上放置 30 分钟。（3）将管放入预加温到 42的水浴中，热激 90 秒。快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却 12 分钟。（4）每管中加 700l LB 培养基，37振荡培养 1 小时，进行复苏。（5）室温 4,000rpm 离心 5 分钟，弃去上清后，用剩余 100
21、l 培养基重悬细胞并涂布到含抗性的 LB 琼脂平板表面。注意：细胞用量应根据连接效率和感受态细胞的效率进行调整。（6）将平板置于室温直至液体被吸收。（7）倒置平皿，于 37培养，1216 小时后可出现菌落。 5、siRNA 的转染dsRNA 的导入方法不同的生物体可以选择不同的方法。简单生物,如单细胞生物等,可选用电穿孔的方法; 较复杂生物可选用 dsRNA 微注射入生殖细胞或早期胚胎,线虫也能采用肠道或假体腔注射的方法,与微注射相比 ,RNAi 效率上并无显著差别。还有浸泡法、工程菌喂养法、磷酸钙共沉淀法等。若使用的是化学法人工合成的 siRNA(正义链和反义链) ,还要经过退火过程,以双链
22、的形式导入靶细胞。有人提出了以质粒或病毒为载体, 通过转导或转染途径,在细胞内以 DNA 为模板,利用 RNA 聚合酶 ,转录为 siRNA(直接形成双链或通过回文序列折叠后形成发夹结构) ,也能产生较明显的 RNAi 效应。最近, 又有一种新的导入方法,就是借助高压水枪的外力将构建的质粒直接自小鼠的尾静脉注入体内, 观察 RNAi 在活体生物模型而不是培养细胞上的基因沉默效应 ,但观察到的 siRNA 的半衰期较短,而且由于使用了高压的外力,过程较复杂 ,限制了其在人类疾病治疗方面的应用。而 Pachuk 等则提出了肌注的方法,将针对 IL12 的 siRNA 的质粒表达载体导入小鼠体内,得
23、到的 RNAi 效应更持久。6、RNAi 效果检测RNAi 效果可从 mRNA 和蛋白质两个水平来进行量化。在 mRNA 水平上，Northern Blot 和实时定量 PCR 是两种常用方法。值得注意的是在进行实时定量 PCR 时，cDNA 合成要用 oligo(dT)，而不是随机引物，且预扩增片段最好位于靶 mRNA 序列中 siRNA 位点的上游。蛋白质水平可以通过 Western Blot、荧光免疫检验法、流式细胞分析术和表型分析来检测。RNAi 一般在转染后 24 小时内发生，其引发基因沉默的程度和持续时间依赖于靶蛋白质的降解率(turnover rate of the protei
24、n)、siRNA 在细胞内的寿命以及其逐渐被稀释的程度。四、RNAi 的前景展望1、研究基因功能的新工具 已有研究表明 RNAi 能够在哺乳动物中灭活或降低特异性基因的表达，制作多种表型，而且抑制基因表达的时间可以随意控制在发育的任何阶段，产生类似基因敲除的效应。线虫和果蝇的全部基因组序列已测试完毕，发现大量未知功能的新基因，RNAi 将大大促进对这些新基因功能的研究。与传统的基因敲除技术相比，这一技术具有投入少，周期短，操作简单等优势，近来 RNAi 成功用于构建转基因动物模型的报道日益增多，标志着 RNAi 将成为研究基因功能不可或缺的工具。 2、研究信号传导通路的新途径联合利用传统的缺失
25、突变技术和 RNAi 技术可以很容易地确定复杂的信号传导途径中不同基因的上下游关系，Clemensy 等应用 RNAi 研究了果蝇细胞系中胰岛素信息传导途径,取得了与已知胰岛素信息传导通路完全一致的结果,在此基础上分析了 DSH3PX1 与 DACK 之间的关系, 证实了 DACK 是位于 DSH3PX1 磷酸化的上游激酶. RNAi 技术较传统的转染实验简单、快速、重复性好，克服了转染实验中重组蛋白特异性聚集和转染效率不高的缺点， 因此认为 RNAi 技术将可能成为研究细胞信号传导通路的新途径。3、开展基因治疗的新策略RNAi 具有抵抗病毒入侵，抑制转座子活动，防止自私基因序列过量增殖等作用
26、，因此可以利用 RNAi 现象产生抗病毒的植物和动物，并可利用不同病毒转录序列中高度同源区段相应的 dsRNA 抵抗多种病毒。肿瘤是多个基因相互作用的基因网络调控的结果，传统技术诱发的单一癌基因的阻断不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长, 而 RNAi 可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性, 设计针对这一区段序列的dsRNA 分子，只注射一种 dsRNA 即可以产生多个基因同时剔除的表现，也可以同时注射多种 dsRNA 而将多个序列不相关的基因同时剔除。尽管目前 RNAi 技术在哺乳动物中的应用还处于探索阶段，但它在斑马鱼和老鼠等脊椎动物中的成功应用预示着 RNAi 将
27、成为基因治疗中重要的组成部分，人工合成的 dsRNA 寡聚药物的开发将可能成为极具发展前途的新兴产业。参考文献：RNAi 在肿瘤治疗中应用的研究进展作者：罗军，王程，芦晓静 作者单位：吉林医药学院生化教研室，吉林 吉林 RNAi 技术策略(哺乳动物细胞篇)http:/ J.Hannon，(2002) Nature,418,2442陈颖朱明华（2003） 中国生物工程杂志 ，23（3）， 393陈忠斌,于乐成,王升启 (2002) 中国生物化学与分子生物学报 18 (5) :5254吴青（2003） 中国生物工程杂志 ，23（1），925张敏（2003） 国外医学分子生物学分册， 25（1）， 556Rander ES et al.Nature, （2001）; 409，8607B renda L et al.Nature, （2002）; 411，428
