1、基因沉默与 RNAi 技术定义：基因沉默双是指链 RNA 被特异的核酸酶降解，产生干扰小 RNA(siRNA)，这些 siRNA与同源的靶 RNA 互补结合，特异性酶降解靶 RNA，从而抑制、下调基因表达。RNA 干扰是指在进化过程中高度保守的、由双链 RNA 诱发的、同源 mRNA 高效特异性降解的现象。由双链引发的植物 RNA 沉默，主要有转录水平的基因沉默 (TGS)和转录后水平的基因沉默(PTGS) 两类 :TGS 是指由于 DNA 修饰或染色体异染色质化等原因使基因不能正常转录 ;PTGS 是启动了细胞质内靶 mRNA 序列特异性的降解机制。有时转基因会同时导致 TGS 和PTGS。
2、基因沉默是一种 RNA 干扰技术。RNA 干扰是由双链 RNA 引发的转录后基因静默机制。其原理是：RNaseIII 核酶家族的Dicer，与双链 RNA 结合，将其剪切成 21 - 25nt 及 3端突出的小干扰 RNA (small interfering RNA，siRNA) ，随后 siRNA 与 RNA 诱导沉默复合物(RNA - induced silencing complex，RISC 结合，解旋成单链，活化的 RISC 受已成单链的 siRNA 引导，序列特异性地结合在靶mRNA 上并将其切断，引发靶 mRNA 的特异性分解，从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制.一、基因
3、沉默的分类及其机制（一）转录水平基因沉默转录水平基因沉默是指对基因专一的细胞核合成的失活，它的发生主要是由于基因无法被顺利转录成相应的而导致基因沉默。转录水平基因沉默可以通过有性世代传递，表现为减数分裂的可遗传性。引起转录水平基因沉默的机制主要有以下几种：基因及其启动子甲基化甲基化是活体细胞中最常见的一种共价修饰形式，通常发生在的序列的碱基上，该区碱基甲基化往往导致转录受抑制，该区甲基化的频率在人类及高等植物中分别可达和。 近来的研究表明，发生在转基因启动子端的甲基化是造成转录水平基因沉默的主要原因。虽然转基因的甲基化可延伸至转基因的端，但甲基化过程均是从启动子区域开始的。从所报道的转基因沉默
4、例子来看，几乎所有的转基因沉默现象与转基因及其启动子的甲基化有关。同源基因间的反式失活反式失活主要是由于拥有同源序列的沉默位点和其他位点的的相互作用而引起的基因沉默。通过顺式作用而甲基化并失活的基因能作为一种“沉默子“ ，对其他与之分离的具有同源性的靶基因施加一种反式作用，使具有同源序列的靶基因发生甲基化并导致失活。反式失活的靶基因既可以与沉默基因是等位基因，也可以是非等位基因。后成修饰作用导致的基因沉默后成修饰作用是指转基因的序列和碱基组成不发生改变，但是其功能却在个体发育的某一阶段受到细胞内因子的修饰作用后而关闭。这种修饰作用所造成的转基因沉默是可以随着修饰作用的解除而被消除。后成修饰作用
5、导致的转基因沉默与受体植物的核型构成有关。重复序列外源基因如果以多拷贝形式整合到同一位点上，形成首尾相连的正向重复或头对头、尾对尾的反向重复，则不能表达，而且拷贝数越多，基因沉默现象越严重。这种重复序列诱导的基因沉默与在真菌中发现的重复序列诱导的点突变相类似，均可能是重复序列间自发配对，甲基化酶特异性识别这种配对结构而使其甲基化，从而抑制其表达。位置效应位置效应是指基因在基因组中的位置对其表达的影响。当外源基因整合到高度甲基化、转录活性低的异染色质区域时，外源基因一般表现沉默，这说明毗邻的甲基化和异染色质化对插入的外源基因影响很大，可能导致外源基因在转录水平上失活。如果转基因插入转录不活跃区域
6、或异染色质区域，转基因通常会融人该区域的染色质结构，使转基因进行很低水平的转录，或使转基因发生异染色质化而导致转基因沉默。（二）转录后水平基因沉默转录后水平基因沉默是指基因在细胞核内能稳定转录，但在细胞质里却无相应稳定态存在的现象。与转录水平基因沉默不同，转录后水平基因沉默具有逆转性，即受抑制基因通过减数分裂可以恢复表达活性，表现为减数分裂不可遗传性。目前发现主要有以下几种转录后水平基因沉默现象。共抑制共抑制是最常见的转录后水平基因沉默。这一现象首先由在转基因的矮牵牛花中发现。共抑制现象普遍存在于转基因植物中。共抑制的发生是由于外源基因编码区与受体细胞基因间存在同源性而导致外源基因与内源基因的
7、表达同时受到抑制。具有同源性的外基因和内源基因在细胞核内的转录速率很高，但在细胞质内无积累，是典型的转录后水平基因沉默。若导入的外源基因与内源基因无序列同源性，外源基因自身也常常会发生转录后水平基因沉默。有关研究发现，共抑制的产生不仅同内、外源基因间编码区的同源性有关，还与控制外源基因的启动子的强度等因素有关。基因压制等在粗糙脉抱霉的转化实验中发现，外源基因可以抑制自身和相应内源基因的表达，他们把这一现象定为基因压制。等是以类胡萝卜素生物合成基因作为视觉报道基因来研究基因压制的。他们发现，基因压制是可逆的，而且这种逆转会伴随有外源拷贝的丢失。基因压制发生在转录后水平，导致已复制的稳定态大量减少
8、。干扰干扰是年首次在秀丽线虫中发现并证明属于转录后水平的基因沉默。利用小片段双链可以特异性地降解相应序列的，从而特异性地阻断相应基因的表达。干扰广泛存在于从真菌到植物、从无脊椎动物到哺乳动物的各种生物中。的作用机制目前尚不完全清楚，学者们在线虫、果蝇、植物和动物卵细胞的实验中，最近相继发现了一些与作用相关的酶和蛋白，如特异性核酸内切酶、依赖性聚合酶、蛋白等。现已初步阐明的作用机制如下：各种通过各种转染技术转入细胞内，较长被的酶样特异性核酸内切酶切割产生的小干扰，两条单链末端为磷酸和羟基，且端都有个突出的核苷酸。核酸内外切酶、解旋酶与蛋白相连进而与一起形成具有多个亚单元的诱导的沉默复合体中的解旋
9、酶应用解开双链，使其反义链互补结合到靶向的上与之相匹配的特异性序列，中的核酸酶降解，从而使目的基因沉默，产生现象。也能与和联系在一起，在解开的双链后，反义链能作为双链合成的一个引物以为模板，在中的的作用下形成新的，再次被识别并切断，形成新的再循环，作用于另外的靶向。这种不断放大的瀑布式作用形成大量新的，使在短时间内迅速并有效地抑制翻译形成蛋白质或多肽，从而有效地抑制靶向基因蛋白质或多肽的合成。蛋白相连进而与一起形成具有多个亚单元的诱导的沉默复合体中的解旋酶应用解开双链，使其反义链互补结合到靶向的上与之相匹配的特异性序列，中的核酸酶降解，从而使目的基因沉默，产生现象。也能与和联系在一起，在解开的
10、双链后，反义链能作为双链合成的一个引物以为模板，在中的的作用下形成新的，再次被识别并切断，形成新的再循环，作用于另外的靶向。这种不断放大的瀑布式作用形成大量新的，使在短时间内迅速并有效地抑制翻译形成蛋白质或多肽，从而有效地抑制靶向基因蛋白质或多肽的合成。二、基因沉默的相关实验技术及其进展目前在基因沉默中主要是干扰的实验技术应用较多，根据靶合成的方法可将技术分为种。体外化学合成法最为经典的方法，共分个步骤：（）化学合成；（）将导入宿主细胞；（）检测靶基因抑制效率；（）功能研究。其中，合成成本很高，转入宿主细胞效率及其在宿主细胞中的稳定性均不确定。体外转录法这种方法采用聚合酶，以先合成的链为模板反
11、转录合成，从而使合成的成本大大降低，但这种方法与化学合成法有相同的缺点。体内载体合成法这是近年来迅速发展起来，克服了前两种方法缺点的新技术。它是年等首先报道的利用载体在细胞体内稳定地表达，从而抑制哺乳动物细胞靶基因表达的方法。其基本思路如下：细胞内存在，它可以识别启动子，从而使启动子后的基因转录成。当模板连续出现个“碱基时，转录就会终止。根据这一机制，可以设计一种能表达的质粒，其组成包括部分：（）常用质粒的基本序列；（）启动子，位于克隆位点的上游；（）克隆位点；（）模板序列（） 。这部分序列具有如下特点：含序列，对哺乳动物而言，通常为个核苷酸；发夹结构环状部分，通常有个核苷酸；靶序列的反向互补
12、序列；个核苷酸“。将具有如上结构的质粒导入细胞内，体内的就可以合成一条链，这条链可以通过两端的个左右的核苷酸反向互补特性而形成发夹样双链结构，从而起到基因抑制作用。这种技术操作简便，成本低，与直接导入相比，质粒更易导入细胞内，而且质粒导入细胞后存在时间长且稳定，对靶基因的表达抑制效率高，便于进行较长时间的基因功能研究，因而成为一种热门技术。近年来多位作者几乎同时报道了利用上述载体技术成功地抑制哺乳动物细胞基因表达的实验。除质粒载体外，现已有成功地采用逆转录病毒载体和腺病毒载体将表达的模板序列转移入哺乳动物细胞的报道。三、基因沉默的应用前景抗肿瘤具有特异、高效的特点，因此可用于一些肿瘤的治疗。最
13、近等把针对基因的杂交体转染到人前列腺癌细胞中，产生长时期阻抑表达效应，此效应与体外培养的前列腺癌细胞中的相似，进而说明哺乳动物中可以发生。教授应用技术特异性地成功沉默了感染的宫颈癌细胞中的基因，宫颈细胞内的和蛋白恢复正常功能，从而恢复了宫颈细胞内正常的防御功能，使已感染的宫颈癌细胞遭遇自杀，而对其他健康细胞的正常生长和生物学行为无影响。可以预见此技术也可应用于与感染相关的肝细胞性肝癌的基因治疗。有学者认为，应用技术抑制肿瘤细胞中血管生长因子如血管生成素、及等或其受体的表达，以及抑制肿瘤细胞中如癌基因、等突变基因及其蛋白的表达而不影响非突变基因的表达，可达到很好的抗肿瘤生长及抗肿瘤转移的目的。抗
14、病毒斯坦福医学院的研究者把放进小鼠的肝细胞，被小鼠体内的核酸酶分解成许多，研究发现具有高度专一性，会与小鼠体内的丙型肝炎病毒的相结合，使分解并失去翻译蛋白质的功能。斯坦福医学院运用此技术来治疗丙型肝炎的研究，已从体外试管实验阶段推进至体内的动物实验，且在小鼠身上，看到丙型肝炎病毒被阻断的明显效果。RNA 干扰实验转染试剂对照（监控转染及培养条件对结果的影响） ；nonsense siRNA 对照（监控外源核酸本身对结果的影响） ；positive siRNA 对照（监控假阴性） ；技术重复对照（也叫 off-target 对照，也就是利用至少 2 个靶点的 siRNA 同时实验，2个 siRN
15、A 互为 off-target control，当两者的表型相同时，才有可能是特异性的 knockdown 效应） ；rescue 对照（knockdown 之后做超表达，看是否有性状的逆转，这也是为了说明knockdown 的特异性） ；6.全表达组扫描对照（就是转录/表达芯片扫描，以最终确定表型不是由于 off-target 造成） 。实际实验中，全表达组扫描对照很少有文献涉及。其它几个对照中，1,2 两种对照即所谓的空白细胞对照、NC 对照，基本是所有杂志都要求具备的。4,5 两种对照，主要是为了解决off-target 效应，选做一种即可，一般建议选 5，涉及的实验即所谓的“RNA 干
16、扰回复实验“，RNA 干扰效率的检测（体外）一般应该从 mRNA 水平、蛋白质水平、细胞表型水平三个层次来检测干扰效率。mRNA 水平：RT-PCR 、Real-time PCR；蛋白质水平：Western-blot、ELISA 、免疫组化；细胞表型水平：MTT、克隆形成实验、流式细胞检测、细胞小室实验等。RNA 干扰效率在动物模型上的进一步验证（体内） 动物模型实验可以采取“体内法“ 和“体外法“ 。体内法，即先做裸鼠成瘤模型，再将质粒或病毒导入裸鼠，检测 RNA 干扰效果。此法操作复杂，对质粒和病毒产品的质和量要求都较高，但是比较贴近实际，说服力较显著。体外法，即先将质粒或病毒导入肿瘤细胞
17、，再将肿瘤细胞导入动物体内，然后检测 RNA 干扰效果。此法操作较简单，对质粒和病毒产品的质量要求较低，所以为大多数文献所采用。建议采用此方法来进行动物模型水平的实验。RNAi 在探索基因功能中的应用人类基因组计划的完成标志着后基因组时代的来临。阐明人类基因组中功能基因表达产物的生物学作用对医学发展有着深远意义。在 RNAi 技术出现以前，基因敲除（gene knockout）是主要的反向遗传学（reverse genetics）研究手段，但其技术难度较高、操作复杂、周期长。由于 RNA 技术可以利用 siRNA 或 siRNA 表达载体快速、经济、简便的以序列特异方式剔除目的基因表达，所以已
18、经成为探索基因功能的重要研究手段。同时 siRNA 表达文库构建方法的建立，使得利用 RNAi 技术进行高通量筛选成为可能，对阐明信号转导通路、发现新的药物作用靶点有重要意义。RNAi 在基因治疗领域中的应用RNAi 作为一种高效的序列特异性基因剔除技术在传染性疾病和恶性肿瘤基因治疗领域发展极为迅速。在利用 RNAi 技术对 H-1 、乙型肝炎、丙型肝炎等进行基因治疗研究中发现，选择病毒基因组中与人类基因组无同源性的序列作为抑制序列可在抑制病毒复制的同时避免对正常组织的毒副作用。同时将抑制序列选择在特定的位点，可对部分有明确基因突变的恶性肿瘤细胞如含有 BCL/ABL 或 AML1/MTG8
19、融合基因的白血病细胞产生凋亡诱导作用。此外尚可通过使用肿瘤特异性启动子如 hTERT 启动子、survivin 启动子或组织特异性启动子如酪氨酸酶启动子、骨钙素启动子引导针对某些癌基因或抗凋亡分子的 siRNA 或 shRNA 表达，从而达到特异性杀伤肿瘤细胞的目的。RNAi 在整形外科领域的应用前景已证实 N-Ras 或 BRAF 的激活型突变是引发黑素瘤的主要病因，其中 66%的病例为 BRAF 激酶作用域突变。而约 80%的 BRAF 突变病例是因胸腺嘧啶突变为腺嘌呤造成第 599 位的缬氨酸突变为谷氨酸所致。使用 RNAi 技术剔除黑素瘤细胞的 BRAF 表达，不仅抑制了肿瘤细胞生长，
20、而且减弱了其侵袭能力，为黑素瘤基因治疗奠定了基础。研究表明趋化因子受体 CXCR4 是乳腺癌转移的重要调节因素，其配体 CXCL12 可趋化肿瘤细胞并调节其增生和侵袭特性。使用 RNAi 干扰技术剔除 CXCR4 证实该分子为原位移植肿瘤生长和转移所必需。此外，剔除 BCRP 表达可以逆转其介导的肿瘤耐药。瘢痕疙瘩是一种较为难治的疾病，尚无有确切疗效的治疗方法。使用特异性 siRNA 剔除TGF-型受体表达可以抑制角膜成纤维细胞表达纤维粘连蛋白并降低其迁移能力。剔除CTGF 表达可使皮肤成纤维细胞内 I 型和型前胶原蛋白、碱性成纤维细胞生长因子、组织金属蛋白酶抑制因子（tissue inhib
21、itor of metalloproteinase，TIMP）-1 ，TIMP-2 和 TIMP-3 等基因表达水平降低。这些结果提示 TGF- 信号转导通路和 CTGF 均可能是瘢痕疙瘩治疗的潜在靶点。病毒性疾病的治疗加州大学洛杉矶分校和加州理工学院的研究人员开发出使用 RNAi 技术来阻止艾滋病病毒进入人体细胞。这个研究小组设计合成的 lenti 病毒载体引入 siRNA，激发 RNAi 使其抑制了H-1 的 coreceptor-CCR5 进入人体外周 T 淋巴细胞，而不影响另一种 H-1 主要的coreceptor-CCR4，从而使以 lenti 病毒载体为媒介引导 siRNA 进入细
22、胞内产生了免疫应答，由此治疗 H-1 和其他病毒感染性疾病的可行性大大增加。RNAi 还可应用于其它病毒感染如脊髓灰质炎病毒等，siRNA 已证实介导人类细胞的细胞间抗病毒免疫，用 siRNA 对 Magi细胞进行预处理可使其对病毒的抵抗能力增强。在全世界约 30 个国家和地区散发或流行的严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome，SARS）的防治研究中，RNAi 也受到了重视。siRNA 在感染的早期阶段能有效地抑制病毒的复制，病毒感染能被针对病毒基因和相关宿主基因的 siRNA 所阻断，这些结果提示 RNAi 能胜任许多病毒的基因治疗，RNAi将
23、成为一种有效的抗病毒治疗手段。这对于许多严重的动物传染病的防治具有十分重大的意义。遗传性疾病的治疗美国西北大学的 Carthew R W 和日本基因研究所的 Ishizuka A 等人发现 RNAi 同脆性 X 染色体综合征（与 FMR-1 基因异常有关的导致智力低下的染色体病）之间的关系密切，揭示了与 RNAi 相关机制的缺陷可能导致人类疾病的病理机制。遗传性疾病的 RNAi 治疗成为当今研究 RNAi 的又一大热点。肿瘤病的治疗肿瘤是多个基因相互作用的基因网络调控的结果，传统技术诱发的单一癌基因的阻断不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长，而 RNAi 可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性
24、很高的保守序列这一特性，设计针对这一区段序列的 dsRNA 分子，只注射一种 dsRNA 即可以产生多个基因同时剔除的表现，也可以同时注射多种 dsRNA 而将多个序列不相关的基因同时剔除。Maen 等应用 RNAi 技术成功地阻断了 MCF7 乳腺癌细胞中一种异常表达的与细胞增殖分化相关的核转录因子基因 Sp1 的功能。尽管化疗能有效消灭肿瘤细胞，却不能有效的靶向肿瘤细胞，因此，在治疗过程中导致很多正常细胞的死亡，实现靶向肿瘤细胞同样也是以 RNA 干扰为基础的肿瘤治疗的重要发展方向。已有很多针对不同基因的 RNA 干扰在体内和体外有效的抑制了肿 瘤 细 胞 的 生 长，这 些 目 的 基
25、因 包 括 ：B c l-2 、survivin、EGFR、VEGF 等。RNA 干扰代替传统反义核酸进行转录后基因沉默，能高效地特异性抑制目的基因。与传统的方法相比，R NA 干扰技术设计更简便、作用迅速、效果明显，其技术优势还在于能根据不同病情，设计个体化治疗方案。2 在植物学中的应用Napoli 等将 1 个查尔酮合成酶基因（chs）置于 1 个强启动子后导人矮牵牛（Petunia hybrida） ，试图加深花朵的紫颜色。结果部分花的颜色并非期待中的深紫色，而是形成了花斑状甚至白色，而且这种性状可以遗传。因为导入的基因和其同源的内源基因同时都被抑制，他们将这种现象命名为共抑制（co-s
26、uppression） 。类似的结果同样在真菌脉胞菌(Neurospora crassa）中和其它转基因植物中存在。对于部分转基因植物来说，基因沉默可能是因为特异基因的甲基化而导致，这被称为转录水平基因沉默。但确实部分植物中的基因沉默是在转录后发生的，这被称为转录后基因沉默。实验表明在发生 PTGS 的个体中同源转录确实存在，但是很快在胞浆中被降解，没有积聚。Palauqui 等进一步证实，在植物中将出现转基因沉默的植株嫁接到另一没有基因沉默的转基因植株中同样可以导致 PTGS，但对非转基因植株却无效。Cogoni 等证实 PTGS 由一种可扩散的反式作用分子所介导。基因敲除技术基因敲除(kn
27、ockout) 是指一种遗传工程基因修饰技术，针对某个感兴趣的遗传基因，通过一定的基因改造过程，令特定的基因功能丧失，并研究可能进一步对相关生命现象造成的影响，进而推测该基因的生物学功能。原理方法1、利用基因同源重组进行基因基因敲除是 80 年代后半期应用 DNA 同源重组原理发展起来的。80 年代初，胚胎干细胞（ES 细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985 年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到 1987 年，Thompsson 首次建立了完整的 ES 细胞基因敲除的小鼠模型。直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模
28、型中最普遍的使用方法。2、诱导性基因敲除也是以 Cre/loxp 系统为基础，但却是利用控制 Cre 表达的启动子的活性或所表达的 Cre 酶活性具有可诱导的特点，通过对诱导剂给予时间的控制或利用 Cre 基因定位表达系统中载体的宿主细胞特异性和将该表达系统转移到动物体内的过程在时间上的可控性，从而在 1oxP 动物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行遗传修饰之目的的基因敲除技术。人们可以通过对诱导剂给予时间的预先设计的方式来对动物基因突变的时空特异性进行人为控制、以避免出现死胎或动物出生后不久即死亡的现象。常见的几种诱导性类型如下：四环素诱导型；干扰素诱导型；激素诱导型；腺病毒介
29、导型。3基因敲除技术的应用及前景： 建立生物模型。在基因功能，代谢途径等研究中模型生物的建立非常重要。基因敲除技术就常常用于建立某种特定基因缺失的生物模型，从而进行相关的研究。这些模型可以是细胞，也可以是完整的动植物或微生物个体。最常见的是小鼠，家兔、猪、线虫、酵母和拟南芥等的基因敲除模型也常见于报道。 .疾病的分子机理研究和疾病的基因治疗。通过基因敲除技术可以确定特定基因的性质以及研究它对机体的影响。这无论是对了解疾病的根源或者是寻找基因治疗的靶目标都有重大的意义。 .提供廉价的异种移植器官。众所周知，器官来源稀少往往是人体器官移植的一大制约因素，而大量廉价的异种生物如猪等的器官却不能用于人
30、体。这是因为异源生物的基因会产生一些能引起人体强烈免疫排斥的异源分子，如果能将产生这些异源分子的基因敲除，那么动物的器官将能用于人体的疾病治疗，这将为患者带来具大的福音。如：PPL Therapeutics 公司于 1999 年已成功地在猪的体细胞中用基因敲除技术敲除了 1 ，3GT 基因。使每只猪都缺乏产生 a半乳糖基转移酶的基因的个拷贝。这些酶在细胞表面产生一种糖分子，人体的免疫系统可以立即辨认出这种糖分子为异源性，从而引发超急性免疫排斥反应。在缺乏这种酶的情况下，超急性排斥反应即不会再发生10。 . 免疫学中的应用。同异源器官移植相似，异源的抗体用于人体时或多或少会有一定的免疫排斥，使得
31、人用抗体类药物的生产和应用受阻。而如果将动物免疫分子基因敲除，换以人的相应基因，那么将产生人的抗体，从而解决人源抗体的生产问题。 改造生物、培育新的生物品种。细菌的基因工程技术是本世纪分子生物学史上的一个重大突破，而基因敲除技术则可能是遗传工程中的另一重大飞跃。它为定向改造生物，培育新型生物提供了重要的技术支持。Northern blot 是一种通过检测 RNA 的表达水平来检测基因表达的方法，通过 northern blot的方法可以检测到细胞在生长发育特定阶段或者胁迫或病理环境下特定基因表达情况。Northern blot 首先通过电泳的方法将不同的 RNA 分子依据其分子量大小加以区分，
32、然后通过与特定基因互补配对的探针杂交来检测目的片段。方法步骤首先需要从组织或细胞中提取总 RNA ,或者再经过寡聚（dT）纯化柱进行分离纯化得到mRNA。然后 RNA 样本经过电泳依据分子量的大小被分离，随后凝胶上的 RNA 分子被转移到膜上。膜一般都带有正电荷，核酸分子由于带负电荷可以与膜很好的结合。转膜的缓冲液含有甲酰胺，它可以降低 RNA 样本与探针的退火温度，因而可以减少高温环境对 RNA 降解。RNA 分子被转移到膜上后须经过烘烤或者紫外交联的方法加以固定。被标记的探针与RNA 探针杂交，经过信号显示后表明需检测的基因的表达。 Northern blot 实验中阴性对照可以采用已经过
33、 RT-PCR 或基因芯片检测过的无表达的基因。应用Northern blot 可用来检测不同组织、器官；生物体不同发育阶段以及胁迫环境或病理条件下特定基因的表达样式。如 northern blot 被大量用于检测癌细胞中原癌基因表达量的升高及抑癌基因表达量的下降，器官移植过程中由于免疫排斥反应造成某些基因表达量的上升，Northern blot 还可用来检测目的基因是否具有可变剪切产物或者重复序列。细胞转染是指将外源分子如 DNA，RNA 等导入真核细胞的技术。随着分子生物学和细胞生物学研究的不断发展，转染已经成为研究和控制真核细胞基因功能的常规工具。常用步骤1. 转染试剂的准备 将 400
34、ul 去核酸酶水加入管中，震荡 10 秒钟，溶解脂状物。 震荡后将试剂放在20 摄氏度保存，使用前还需震荡。2. 选择合适的混合比例(1：11 ：2/脂质体1 体积：DNA 质量)来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的 MyoD 或者 EGFP 的 DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。3. 将混合液在室温放置 1015 分钟。4. 吸去培养板中的培养基，用 PBS 或者无血清培养基清洗一次。5. 加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。6. 到时后，根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养 2448 小时。细胞转染技术原理及应用
35、规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染（永久转染） 。前者外源DNA/RNA 不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。一般来说，超螺旋质粒DNA 转染效率较高，在转染后 24-72 小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白， 半乳糖苷酶等来帮助检测。后者也称稳定转染，外源 DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在。尽管线性 DNA 比超螺旋 DNA 转入量低但整合率高。外源 DNA 整合到染色体中概率很小，大约 1/104 转染
36、细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶（APH；新霉素抗性基因） ，潮霉素 B 磷酸转移酶（HPH ） ，胸苷激酶（TK）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。反转录 PCR（Reverse Reaction，RT-PCR）又称为逆转录 PCR。其原理是：提取组织或细胞中的总 RNA，以其中的 mRNA 作为模板，采用 Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。实验步骤1. 总 RNA 的提取。2. cDNA 第一链的合成（Reverse Transcription）：如今试剂公司有多种 cDNA 第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。现以 GIB
37、ICOL 公司提供的 SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。（1 ）在 0.5ml 微量离心管中，加入总 RNA 1-5g，补充适量的 DEPC H2O 使总体积达11 l。在管中加 10M Oligo（dT）12-18 1l，轻轻混匀、离心。（2 ） 70加热 10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少 1min。然后加入下列试剂的混合物：10PCR buffer 2l25mM MgCl2 2l10mM dNTPmix 1l0.1M DTT 2l轻轻混匀，离心。42孵育 2-5m
38、in。（3 ）加入 Superscript1 l ，在 42水浴中孵育 50min。（4 ）于 70加热 15min 以终止反应。（5 ）将管插入冰中，加入 RNase H 1l ，37孵育 20min，降解残留的 RNA。-20保存备用。3 PCR：（1 ）取 0.5ml PCR 管，依次加入下列试剂：第一链 cDNA 2l上游引物（10pM） 2l下游引物（10pM） 2ldNTP(2mM) 4l10PCR buffer 5lTaq 酶（ 2u/l） 1l（2 ） 加入适量的 ddH2O，使总体积达 50l。轻轻混匀，离心。（3 ） 设定 PCR 程序。在适当的温度参数下扩增 28-32
39、个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在 PCR 扩增目的基因时，加入一对内参（如 G3PD）的特异性引物，同时扩增内参 DNA，作为对照。（4 ） 电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。（5 ） 密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。慢病毒（Lentivirus ）载体是以 HIV-1（人类免疫缺陷 I 型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体较逆转录病毒载体有更广的宿主范围，慢病毒能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。慢病毒载体能够产生表达 shRNA 的高滴度的慢病毒，在周期
40、性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达 shRNA，实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默，为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。慢病毒作为 siRNA 的携带者，不但具备特异性地使基因表达沉默的能力，而且充分发挥了慢病毒载体自身所具备的优势，为基因功能的研究提供了更强有力的工具。慢病毒载体可以将外源基因或外源的 shRNA 有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。对于一些较难转染的细胞， 如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因或目的 s
41、hRNA 的转导效率，且目的基因或目的 shRNA 整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的 shRNA 的长期、稳定表达。对于一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞，通过病毒介导的实验能够大大提高基因的转导效率，以达到目的基因的高效瞬时表达。实验流程1. 根据目的基因相关信息（序列，序列号等） ，构建含有外源基因或 siRNA 的重组载体；2. 对于测序正确的重组质粒，提取和纯化高质量的不含内毒素的重组质粒；3. 使用高效重组载体和病毒包装质粒共转染 293T 细胞，进行病毒包装和生产，收集病毒液；4. 浓缩、纯化病毒液；5. 用高质量的病毒液感染细胞；6. 通过定量 PCR 精确测定病毒滴度（高精确滴定方法）和 Western 分析实验结果；7. 用高质量的病毒液感染宿主细胞；检测基因功能或者 siRNA 的沉默效率以及使用药物进行稳定转染细胞株的筛选，通常状况下，筛选的细胞克隆株具有长期的表达稳定性。
