1、抗癌的吲哚酚类通过抑制硫氧还原蛋白酶和活化信号的氧化还原来诱导人胰腺癌细胞的凋亡摘要：吲哚酚类研制成为潜在的抗人胰腺癌的因子。通过测定 IC50，IQs 在低纳摩尔浓度下就表现对胰腺癌细胞系 MIAPaCa-2 强有力的抗癌活性。 IQs50 诱导的细胞凋亡是时间和浓度依赖性的，而且和其他浓度依赖的抑制剂诱导生长抑制的影响而言，IQs 是 MIA PaCa-2 细胞中硫氧还原蛋白酶 1（TR1）的强有力的抑制剂。TR1 通过 IQs 而被抑制的机制在无细胞体系中用纯化的酶做具体的研究。使用液相色谱 - 串联质谱法分析发现，TR1的 C-末端硒代半胱氨酸被认为是 IQ 衍生出来的活性亚胺的主要内
2、收位点。通过 IQs，在MIA PACA-2 细胞中， TR1 的抑制导致了硫氧还蛋白-1 的氧化还原状态转变为氧化形式以及活化 p38 和 c-Jun NH2-末端激酶（JNK） ，促分裂原活化蛋白激酶（ MAPK）信号通路。氧化的硫氧还蛋白被认为激活了细胞凋亡信号调节激酶 1是在 MAPK 信号级联中的p38/JNK 上游活化酶，这些已经在研究中被证实，从而提供了 Q-诱导的细胞凋亡的潜在机制。这些数据描述了在人胰腺癌细胞系中的氧化还原以及参与了被 TR1 的新型抑制剂诱导的生长抑制机制的信号事件。引言：之前我们已经报道了一系列新型吲哚酚类的发展，在胞内胞外，它们都表现出对人胰腺癌细胞明显
3、的生长抑制(Yan et al., 2009)。这些化合物共有吲哚酚类的骨架结构，但是在醌环和吲哚环上有不同的取代。两类 IQs 被发现是对各种人胰腺癌细胞系极其有效的药物，达到 IC50 的生长抑制时是在低的纳摩尔浓度范围，这两类即为 2-羟甲基类（例如 2-羟甲基-5-甲氧基-1-甲基-3-(4-硝基苯氧基) 甲基吲哚-4,7-二酮（1） ；Fig.1 和 2 位未取代的吲哚酚类【如，5-甲氧基-1- 甲基-3-【(2,4,6-三氟苯氧基）甲基 】吲哚-4,7- 二酮（2） ；Fig,1 】 。 (Yan et al.,2009)。在 NCL-60 肿瘤细胞系培养中，两类分子都表现出一种细
4、胞毒性的模式，这表明，对结肠癌，肾癌和黑色素瘤细胞系，两类分子都有优先的毒性模式(Yan et al., 2009)。IQs的 NCI-60 作用模式和先前报道硫氧还蛋白还原酶抑制剂 4 -（苯并噻唑-2 - 基）-4 - 羟基-2,5 - 环己二烯-1 - 酮（AW464）的相似处（Chew 等人， 2008） ，引起一个猜想人硫氧还蛋白系统可能是 IQs 的分子靶。细胞质硫氧还蛋白系统，包括硫氧还蛋白-1，硫氧还蛋白还原酶 1（TR1） ，和NADPH，在维持细胞内的蛋白的硫醇的氧化还原平衡中（Arner 和 Holmgren 说，2006 年）中发挥核心作用。硫氧还蛋白系统具有用于细胞功
5、能所必需的许多生物活性。首先，硫氧还蛋白参与抗氧化防御，主要通过作为对硫氧还蛋白过氧化物酶的电子供体，用巯基以清除氧化剂 (Berggren et al., 2001).其次，降低的硫氧还蛋白使得核糖核苷酸还原酶的相等的降低量，核糖核苷酸还原酶催化核糖核苷酸转化为脱氧核糖核苷酸（洛朗等人，1964） ，是 DNA 合成和细胞增殖的关键步骤之一。第三，硫氧还蛋白调节转录因子结合 DNA 的活性，如糖皮质激素受体，转录因子IIIC， 核因子 -B，p53 和激活蛋白-1 （FOS/Jun）,通过他们的 DNA 结合结构域处的半胱氨酸残基的氧化还原调控来实现。 (Cromlish and Roede
6、r 1989; Grippo et al., 1983;Abate et al., 1990; Matthews et al., 1992; Ueno et al., 1999).最后，对于 IQs 的凋亡作用也是最重要的，降低硫氧还蛋白可能通过结合到细胞凋亡信号调节激酶 1（ASK1）然后抑制其激酶活性，作为细胞凋亡的抑制剂。 从 ASK1 中，硫氧还蛋白氧化的解离导致 ASK1 激活和下游的细胞凋亡(Ichijo et al., 1997;Saitoh et al., 1998).我们之前的研究表明靶位点 TR1 可能是引起 IQ 毒性的潜在机制。在这项研究中，我们在人胰腺癌细胞中阐明了
7、TR1 作为 IQs 的靶位点。在无细胞和细胞系统中，这些 IQs 都抑制了 TR1，导致通路级联的活化，包括 ASK1 和 P38/JNK MAPKS 的信号通路。这些结果描述了在人胰腺癌细胞中的氧化还原和与 IQs 毒性机制相关的信号通路。材料和方法材料：1）2-羟甲基-5- 甲氧基-1-甲基-3-(4-硝基苯氧基)甲基 吲哚 -4,7-二酮（1） ；5-甲氧基-1-甲基-3-【(2,4,6-三氟苯氧基）甲基】吲哚-4,7- 二酮（2） ；】被合成2）重组人 NRH:醌氧化还原酶 2（NQO2）自 Sigma-Aldrich（圣路易斯，密苏里州）得到。3）核苷（NRH）合成在我们的实验室中
8、使用发布程序（。Friedlos 等，1992;燕等人2008 年）4）重组小鼠 TR1 从 IMCO Corporation Ltd 购买5）TR1 的抗体，磷酸化 ASK1，全部 ASK1 从 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz,获得6）抗硫氧还蛋白-1，磷酸化 p38（Thr180/ Tyr182）和磷酸化 JNK（Thr183/ Try185）从）Cell Signaling Technology (Danvers, MA)获得7）细胞色素 c 的抗体是从 BD Pharmingen (San Diego, CA)购买8）P38 抑制剂 4-（4-
9、 氟苯基）-2 - （4 - 甲基亚磺酰苯基）-5 - （4 - 吡啶基）1H- 咪唑 （SB203580 ）和 JNK 抑制肽 L-JNKi 购自 Enzo Life Sciences, Inc. (Plymouth Meeting, PA)，PA） 。9）转染质粒转染 pCMV-SPORT6-ASK1 从 Open Biosystems (Huntsville, AL)购买（亨茨维尔） 。10）膜联蛋白 V 染色试剂盒和 EnzChek 荧光 Caspase-3 活性试剂盒购自 Invitrogen 公司（卡尔斯巴德获得，CA）中。11）除非指明，所有其它化学品购自 Sigma-Aldri
10、ch 公司细胞系和转染。1）MIA PACA-2 人胰腺癌癌细胞从 American Type Culture Collection (Manassas, VA)获得。2）细胞培养于 Dulbecco 改良的 的 Eagle 培养基，调节至含有 4mM 的 L-谷氨酰胺，10（体积/体积）胎牛血清， 2.5（体积/ 体积）马血清， 100 单位/ ml 青霉素，和 100 微克/毫升链霉素。细胞保持在湿润的培养箱中含有 5二氧化碳，37。3）对于瞬时转染 研究，MIA PACA-2 细胞通过电穿孔转染 含有 ASK1 基因的人类巨细胞病毒驱动载体 pCMV-SPORT6 或单独的载体。4）然后
11、将细胞在完全生长培养基中温育 16 小时，之后再用 IQs 处理生长抑制试验1）使用生长抑制测定的 MTT 比色分析法（参见 Mosmann，1983）2）在这些研究中，将对数期的细胞以每孔 2103 个细胞接种到 96 孔板，一式三份，并且使得贴壁 16h。 3）然后用含有 IQs 的完全培养基（200 微升/ 孔）处理 72 小时或治疗为 4 小时无药物的培养基孵化后，接着培养在药物培养基，37额外 72 小时。4）去除培养基，50 微克 MTT 添加到 50 微升的完全培养基后，添加到每一孔中，再孵化 4 小时。5）细胞存活率通过测量来确定 MTT 还原成结晶甲臜的产物，加入 100 微
12、升 DMSO 讲产物溶解。6）光密度在使用 Thermomax 酶标仪 550nm 波长测定 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).7）IC 50 值被定义为 IQ 的浓度 与对照组相比，导致降低了 50的细胞数的浓度。细胞凋亡的流式细胞仪检测1）细胞（4105）分别接种到 60 毫米的培养皿。药物处理后，将细胞收集，用 PBS洗涤，重悬在膜联蛋白结合缓冲液和膜联蛋白 V-异硫氰酸荧光素和 PI 中，根据厂商的说明。(Biosource Annexin V detection kit; Invitrogen)2）膜联蛋白 V 和 PI 染色使用 FACSCali
13、bur 流式细胞仪进行分析 (BD Biosciences, San Jose, CA)。细胞被阳性膜联蛋白-V 染色的计为凋亡细胞。caspase-3 活性测定1)caspase-3 的活性测定使用 EnzChek caspase-3 的测定按照试剂盒（Invitrogen 公司)制造商的说明。简言之，将细胞收集到的裂解缓冲液和超声处理，细胞裂解物中的胱天蛋白酶-3 活性用荧光测定通过以下所述基板的切割所测量 -苄氧羰基-DEVD-氨基-4 - 甲基香豆素。线粒体细胞色素 c 释放收获细胞并重新悬浮在透化缓冲液（200 微克/毫升的毛地黄皂苷和 80mM 的氯化钾溶于 PBS 中） 。 5
14、分钟后，在冰上温育后，将样品 以 1000g 离心 5 分钟。上清液（细胞质部分）转移到紧接新管和沉淀（线粒体）再悬浮在 RIPA 缓冲液。这两个分数都那么进行免疫印迹细胞色素 C 的分析。蛋白质含量采用 Lowry 等人的方法进行测定。 （1951） 。无细胞体系 TR1 的抑制作用1）抑制反应进行在 100mM 磷酸钾缓冲液， pH7.4，含有 2mM EDTA 和 1 毫克/毫升的牛血清白蛋白。2）0.5 微 mol 重组大鼠 TR1，250 微 mol 的 NADPH，2 微 mol 的 NQ02，和 200 微mol 的 NRH 的混合物在上述缓冲液中孵育，在室温温度下保持 5 分钟
15、。3）然后，不同浓度的 IQs 分别为加入（该混合物的终体积为 150 微升） ，30min 内，每 5 分钟取 20 微升样品，测量 TR1 活性，采用 DTNB 还原法，如先前所描述的（Fang等人，2005） 。 4）活性测定混合物含有 100mM 的磷酸钾缓冲液，pH7.4，2mM EDTA 的，1 毫克/毫升牛血清白蛋白，250 M + NADPH 和 2.5mM 的 DTNB。TNB 从 DTNB 的释放的测定是加样品测定 1 分钟内 412nm 的吸光值，计算速度。5）一个空白的读数没有添加样品的样本6）结果表示为对照的百分比（20 微升，加入 IQs 前取出样品） ，并分别代表
16、三个独立的实验。 用质谱分析技术检测在 TR1 中 IQs 修饰的残基 1）分别进行 LC-MS/ MS 实验，用出版方法（善达等人， 2006）进行细微的修改。2）40 微升溶液中包含了 50mM 磷酸钾缓冲液，pH 为 7.4，1mMEDTA,0.5g 的NQO2， 200 微末 NRH,9g 的 TRQ,250 微摩 NADPH，在室温下孵育 15 分钟。3）加入 1 微升的溶解在 DMSO 的 4mM IQs，混合物再孵育 30 分钟4）将反应体系中的蛋白质在 6 微 M 盐酸胍，在 70下进行 30 分钟。5）变性的蛋白质中的半胱氨酸残基，然后通过二硫苏糖醇还原其次是碘乙酰胺烷基化被
17、修饰。6）样本分别用 50mM NH 4 HCO3 稀释 10 倍，分离以 1:50 胰蛋白酶/蛋白质比在 37下过夜。7）消化产品使用 SpeedVac 中（默飞世尔科技，沃尔瑟姆干燥， MA）和重新溶解在0.1三氟乙酸。8）约 10 皮摩尔的 TR1 消化物的使用 ZipTip C18 的设备纯化，然后洗脱到 10 微升50乙腈和 0.1三氟乙酸的在纯水中。9）使用正离子电喷雾电离液相色谱 - 串联质谱（LC-MS / MS） ，Agilent 1100 毛细管 高性能液相色谱系统接口到飞行时间型的四极质谱仪（沃特斯，米尔福德，马萨诸塞州） 配备了 PicoView 纳流源（新的目标公司，
18、马萨诸塞州沃本） 。分析纯化的胰蛋白酶。10）样品采用纳米注射器手动注入 （瓦尔科仪器有限公司，休斯顿，德克萨斯州）到1.0，150 毫米 18 的 MS 柱（格雷斯性 Vydac，Hesperia 的， CA） 。 11）16 分钟从 3%至 80溶剂 B（A ，0.1甲酸：B，90乙腈/ 0.1甲酸） 使用在 350 升/分钟，在 3的 B 的第一分钟，随后通过线性增加至 40B，在 9 分钟，最后保持在 80B 3 min .12）光谱用 Waters 四极杆飞行时间质谱仪以正模式记录。扫描光谱范围为全扫描，设置为 4002000。肽碎片谱的自动分析（MS / MS）基于 MASCO 进
19、行（矩阵科学，伦敦，英国）的计算机算法进行蛋白质数据库搜索和蛋白质鉴定。使用 ProteinProspector 计算的 C-末端肽的理论同位素的分布 细胞中 TR1 活性1）将细胞收集到的 RIPA 缓冲液中， 超声处理，然后离心（13000 rpm 离心15 分钟） ，在上清液中的蛋白质的浓度用洛瑞的方法求得 2）然后在 96 孔板中进行 TR1 活性测定，利用一个端点胰岛素减少测定法如先前所述（Fang 等人，2005） 。简而言之，反应（50 微升）中含有 50 mM 的 Tris-HCl，pH 值7.4，2 mMEDTA，200 微 m 的 NADPH，1.5 毫克/ 毫升 胰岛素，
20、20 M +大肠杆菌硫氧还蛋白（Sigma 公司） ，和 40 微克的蛋白从各细胞提取物。温育 20 分钟，在 37后， 终止反应，加入 200 升的 1 mM 的 DTNB 在 6M 的胍盐酸盐（溶解于 50mM 的 Tris-HCl，pH 8.0）中。3）该游离硫醇在降低胰岛素通过 DTNB 还原，测定吸光度在 412nm 处，其中 1 摩尔二硫化物的产生 2 摩尔游离 TNB 与消光系数 13.6mM1 cm1。 。空白测定各样品，含一切除硫氧还蛋白，以相同的方式进行处理，从相应的样品的值吸光度中减去并空白值。 TR1 的活性表示为 DMSO 处理的对照的百分比。谷胱甘肽还原酶和谷胱甘肽
21、过氧化物酶活性测定1） 在细胞中谷胱甘肽还原酶（GR）的活性测定使用先前描述的方法（Gromer 等人，1998） 。该测定混合物（1ml）溶液由 100mM 磷酸钾，pH 7.0，2mM EDTA 的，和 100 微 M + NADPH。 细胞超声波处理后，NADPH 的消耗相当于在 340nm 处吸光度的减少，在1 mM 的 GSSG 的存在或不存在的情况下。 GR 活性是通过计算在 OD340 加上或去掉GSSG 的速率减少的差异。细胞中的谷胱甘肽过氧化物酶（谷胱甘肽过氧化物酶）活性的测定与 GR 偶联的途径测定如前所述（Gromer 等人，1998） 。该法混合物（1ml ）中含有50
22、mM 磷酸钾，pH8.0，1 Mm EDTA，1 单位/ ml GR，1mM GSH 和 200 微 m 的 NADPH， 平衡 5 分钟;加入细胞超声处理物并孵育 1 分钟。然后，加入基板叔丁基过氧化氢（终浓度1 毫摩尔）到溶液，在 340nm 处测定 NADPH 的消耗。GSH/ GSSG 系数的测定在解冻前将冷冻细胞沉淀物（2106）之前在 150 微 L 冰冷的 0.1N 高氯酸中的超声处理，以防止在制备过程中人为形成巯基二硫化物。 匀浆物在 4下，14000g 离心力下离心 15 分钟。GSH 和 GSSG 在上清液中的水平用高效液相色谱法所报告 ，然后通过 Lowry 等人的方法，
23、标准化为蛋白（ 1951） 。 细胞总非蛋白巯基细胞中的总酸，可溶性硫醇依照发表的方法（确定塞德拉克和林赛 1968 年） 。细胞（2106 ）收集到冰冷的 PBS 及分成两管。然后将细胞在 1000g 离心力下离心 5min 沉淀。在一个管中的细胞沉淀重悬在 RIPA 缓冲液中，用于测定蛋白质浓度，采用 Lowry 等的方法。 （1951） 。在另一个管中的细胞沉淀物溶解于 120 微升的 5三氯乙酸，立即涡旋 10秒，然后以 5000rpm 离心 10 分钟以沉淀细胞蛋白。该上清液移至玻璃管中，玻璃管中含2ml 的 0.4m Tris-HCl，pH 值 8.9，DTNB 加至终浓度 100
24、 微摩尔。样品涡旋并温育 5 分钟，在室温 温度，和吸光度 412nm 处进行测定。结果表示为每毫克蛋白质中的微摩尔的酸可溶性硫醇，通过还原性谷胱甘肽校正曲线计算。细胞中硫氧还蛋白氧化还原状态的测定硫氧还蛋白在细胞的氧化还原状态，如前所述方法确定（Sun and Rigas 2008） 。简言之，将细胞收集到新鲜制备的裂解缓冲液（50mM 的 Tris-HCl，pH 值 8.3，2mM EDTA 的加入6M 胍盐酸盐，0.5的 Triton X-100，和 50mM 碘乙酸） ，然后在黑暗中于 37下进行 30分钟。细胞裂解物再纺通过脱盐柱（微生物旋转; Bio-Rad 实验室，赫拉克勒斯，C
25、A ） ，蛋白质浓度的测定使用 Lowry 等人的方法。 （1951） 。脱盐蛋白（ 50 微克）由 15非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并转移到聚偏二氟乙烯膜。还原的和氧化的硫氧还蛋白-1 的探测用兔抗人 thioredoxin- 1 抗体，并使用增强的化学发光检测。免疫印迹分析细胞接种在 100mm 的培养板，每板 106 个细胞，并用各种浓度的 IQs 处理,用时间作为数据的表征。细胞收集在 RIPA 缓冲液补充了蛋白酶抑制剂 cocktail（罗氏诊断，印第安纳波利斯，IN）和磷酸酶抑制剂混合物（ G-Biosciences 公司，圣路易斯，密苏里州） 。然后将细胞超声波处理并离心（13
26、000 rpm 离心15 分钟） ，并且该蛋白质上层清液的浓度，用该方法为洛瑞。细胞蛋白（50 微克） ，然后用 12SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并转移至聚偏二二氟乙烯膜。然后将膜与探测对磷酸化 p38（Thr180/ Tyr182） ，磷酸化的初级抗体 JNK（Thr183/ Try185） ，磷酸 ASK1（Ser83 ） ，和 肌动蛋白的抗体，二抗为通过辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠/兔免疫球蛋白（杰克逊免疫研究实验室，西树丛，PA） 。检测 Western 印迹信号用增强的化学发光 Western 印迹检测试剂 （通用电气医疗集团，查尔方特圣吉尔斯，白金汉郡，英国） 。所有显示的印
27、迹是代表三个独立的实验。 统计分析使用进行统计分析单向方差分析后适当的事后检查：Dunnett 检验多个观测比较单一 控制;学生的 t 检验进行两两比较。数据被表示作为意思 S.D.的至少三个重复实验。结果用于这项研究的 IQs一系列的 IQs 用我们以前的研究被筛选，可作为对潜在的抗胰腺癌药物（ Yan 等，2009） 。在当前的研究中，两个引入化合物（图 1A） ，IQ 化合物 1 和 2，被选定为研究 IQs对胰腺癌细胞的作用机理。IQs 的作用机制图示于图 1B，包括 IQs 的氧化还原，排出的离去基团，亲电子的产生的烷基化物种（图 1B） 。人类 TR1，其中有一个 C 末端的活性位
28、点硒代半胱氨酸残基，被认为是 IQs 的潜在目标。IQs 对人胰腺癌的生长抑制活性在 MIA PACA-2 胰腺癌细胞系 用 MTT 法对 IQs 1 和 2 对人胰腺癌细胞生长的影响的评估。 这两种 IQs 表现出明显的生长抑制活性，IC 50 值在低纳摩尔范围内的。在 MIA PACA-2 细胞的 IQ1 的 IC 50 值在 4 和 72 小时处理后分别为 96 和 74nM ;在 4 和 72 小时处理后， IQ2 的 IC 50 值分别为 35 和 18nM。该生长抑制的活性也在其他人胰腺癌细胞系PANC-1 和胰腺癌 BxPC-3 被证实两种（数据未显示） 。IQs 诱导胰腺癌细胞
29、凋亡之前我们已经报道了 IQ1 在 1 MIA PACA-2 中诱导 caspase 依赖的凋亡细胞。在目前的研究中，我们证实了 MIA PACA-2 细胞凋亡上剂量依赖性的增加，无论是被 IQ1 或 2 的处理 18h 后，在浓度范围大致相对于 MTT 的 IC 50 值 （图 2，A 和 B） 。IQs 处理后的凋亡事件的详细时程也在 MIA PACA-2 细胞探究；线粒体 中的细胞色素 c 释放到细胞质中，在药物处理 24h 后被检测出来（图 2，C 和 D）中，随后在 46h caspase-3 被激活（图2，E 和 F） ，在处理 8 小时后，细胞凋亡通过膜联蛋白 V 染色表现， （
30、图 2，E 和 F） 。总之，这些数据显示出的 IQs 通过蛋白酶的激活和诱导凋亡表现出细胞毒性。这些数据也表明活化线粒体途径是参与细胞凋亡信号传导的关键事件。 在无细胞体系中 IQs 抑制 TR1因为 IQs 的激活需要被还原，IQs 抑制重组大鼠 TR1 的能力是在无细胞系统中进行测试 ，使用 NQO2 作为的还原活化工序（IQs 测试 并不影响在这些条件下 NQO2 活动; NQO2/ NRH 本身并不影响这些条件下 TR1 活性） 。 当 NADPH 还原的 TR1 被 NQO2/ NRH-还原的 IQ1 或 2 孵育后，观测到 TR1 的活性的剂量依赖性抑制的 （图 3A） 。抑制是
31、 NADPH 依赖的（数据未显示） ，这表明酶的硒代的活性位点参与了 IQs 的抑制 ；抑制也 NQO2/ NRH 依赖性（数据未示出） ，这表明与 TR1 抑制有关的毒性物质的合成是在氧化还原和基团脱去之后。TR1 的抑制似乎是不可逆的，因为 TR1 的酶的使用Millipore 公司的分子截留设备脱盐后并没有导致恢复酶的活性（数据未显示） 。 TR1 的 C-末端硒代半胱氨酸作为 IQ 修饰位点的鉴定 LCMS/ MS 法被用来确定 IQs 的修饰位点。纯化的 TR1 由 IQs 孵化，消化， 并进行MS / MS 分析。如图 3C 中所示， 肽信号表现出 Se 同位素分布格局特点被检测出
32、，分子质量是 1434.47Da，其对应于该分子 TR1 的 C 末端的胰蛋白酶片段加上了 IQ1 衍生的亚胺中间体和一种碘代乙酰胺的修饰的分子质量。所观察到的同位素分布也与理论分布格局一至，理论的是用 ProteinProspector 方案合成的（图 3B） 。为了确定 IQs 内收的确切部位，这种肽被 MS / MS 碎裂，产生的光谱（图 3D）表明位点是硒代半胱氨酸而不是半胱氨酸残基。这些结果确定了 TR1 是被 IQ 衍生的亚胺物质烷基化，从而导致了酶的抑制。IQs 处理 TR1 的选择性抑制人胰腺癌癌细胞IQs 1 和 2 的对细胞内 TR1 的抑制能力在 MIA PACA-2 细
33、胞进行测试。 TR1 活性是使用端点胰岛素还原活性的测定的。方法在材料和方法中已经描述。在 MIA PACA-2 细胞中的 TR1 活性抑制作用是剂量依赖，在 1 小时处理后可以被观测到（图 4，A 观察到两种化合物和 B） 。IQ1 的 TR1 抑制的 IC50 值是 146nM，IQ2 的 IC50是 82nM。 TR1 的抑制作用也时间依赖性的，并最大地抑制在 1 小时处理后出现（图 4 中，C 和 D） 。最活跃 TR1 的抑制剂，是金诺芬（ Urig 和 2006 贝克尔） 。图 4E 表明，IQs 在细胞中对于 TR1 的抑制明显高于金诺芬（高达 11 倍的效力） 。 为了测试 I
34、Qs 选测性的抑制 TR1，,与两个密切相关的酶的活性，GR 和 GPX，在 IQ 处理的 Mia PaCa-2 cells 被测定。 GR 有类似与 TR1 的蛋白结构，但是缺乏缺乏 C-末端硒代半胱氨酸残基（Sandalova 等人，2001） 。 GPx 的是另一种含硒蛋白质，但硒代残基不暴露出来。这两种酶的活性都不受到 IQ 处理不酶的活性受到 IQ 治疗浓度的影响，从而成为了，有效的抑制 TR1（图 4，A 和 B） 。IQs 对 GR 和 GPx 的物抑制活性表明，TR1 的 C 末端硒代半胱氨酸，它是 10 个残基暴露链中的倒数第二个 氨基酸（Cheng 等，2009） ，成为了
35、IQs 的靶点。这些数据还表明，在人体胰腺细胞中，IQ 化合物是 TR1 的相对特异性抑制剂。智商处理对自由基介导的氧化作用 压力，GSH / GSSG 比率和非蛋白巯基的 人胰腺癌细胞。为了测试是否智商 治疗导致在细胞的任何一般的氧化应激，我们 活性氧测定的细胞水平（ROS）的 通过使用荧光探针二氢乙的指示 及 2，7-dichlorofluorescein-二乙酸酯，并没有增加 可检测到荧光（数据未显示） 。作为间接 氧化应激的指示，细胞总非蛋白 硫醇水平和 GSH / GSSG 比例（参考图 1） ，分别为 还确定，并且观察到在任一指标没有改变 经过药物治疗。此外，智商的到能力 在细胞中
36、诱导氧化还原循环是通过测量评估 氧量（克拉克电极） 。智商治疗引起的不 增加氧气吸收在细胞中的速率（数据未 示出） 。这些数据表明，在智商没有诱导 显著氧化还原循环和氧化应激在胰腺癌 癌细胞。 IQ 处理对 Thioredoxin-的氧化还原状态的影响 1 人胰腺癌细胞。该 thioredoxin- 在 MIA 中 PACA-2 细胞 1 的氧化还原状态后进行了评估 1 小时 IQ 治疗。如根据材料和方法所述， 还原和氧化的硫氧还蛋白 1 的形式进行分离 通过后，碘天然蛋白质凝胶电泳 酸处理的细胞的蛋白质。如该图所示。 5， 无论是与智商 1 或 2 的智商引起剂量依赖性的治疗 增加氧化的硫氧还蛋白-1 伴随着下降
