细胞免疫荧光的染色方法

1、影像医学与核医学专业毕业论文 精品论文 基于 H2AX 的免疫荧光分析技术定量检测 CT 照射后人外周血单个核细胞的 DNA 损伤关键词：体层摄影术 X 线计算机 免疫荧光分析 外周血单个核细胞 DNA 双链断裂摘要：第一部分：H2AX 分析定量检测 CT 照射后人外周血单个核细胞 DNA 损伤的体外实验研究 目的： 以 H2AX 的荧光显像和定量检测为依据，通过体外实验研究，初步了解 CT 辐射剂量与人外周血单个核细胞(PBMCs)H2AX 焦点数量之间的相关性。 材料和方法： 67 名志愿者纳入研究，签署知情同意书后，分别经肘静脉采集外周血标本，分装至抗凝管中。

2、 利用免疫荧光染色观察转入 YFP-PKC 的 E6.1 细胞在 CD3/CD28 抗体刺激下活化的影响摘要：T 细胞在接受 CD/3CD28 共刺激信号的作用下，表面蛋白会聚集成帽状结构。本实验通过免疫荧光染色法，观察转入 PKC 的 T 细胞在及是否接受 CD3/CD28 信号刺激等不同条件下，在 IgG 辅助时活化的影响。结果显示转入 PKC 的细胞会形成明显的帽状结构，而空白对照组没有，显示 PKC 对 T 细胞活化的促进作用。关键词：PKC；CD3/CD28；T 细胞在T 细胞中,PKC是诱导AP-1 活化的信号途径中的重要因子。而同时，c-Jun 蛋白N-末端激酶(JNK)的活性可以激活AP-1 。

3、本科毕业论文论文题目：不同固定方法对 Pyk2 免疫荧光染色的影响 学生姓名： 常新莲 学 号 ： 20100130845 专 业 ： 生物科学 指导教师： 孟小倩 学 院： 生命科学学院 2014 年 5 月 18 日毕业论文（设计）内容介绍论文（设计）题 目不同固定方法对 Pyk2 免疫荧光染色的影响选题时间 2014.1 完成时间 2014.5论文（设计）字数9360关 键 词 固定方法， Pyk2，小鼠胚胎细胞，免疫荧光染色论文（设计）题目的来源、理论和实践意义：题目来源：实验室课题理论和实践意义：本文是以正常的雌性小鼠为研究对象，通过不同的染色前固定和透膜方法，。

4、本科毕业论文论文题目：不同固定方法对 Pyk2 免疫荧光染色的影响 学生姓名： 常新莲 学 号 ： 20100130845 专 业 ： 生物科学 指导教师： 孟小倩 学 院： 生命科学学院 2014 年 5 月 18 日毕业论文（设计）内容介绍论文（设计）题 目不同固定方法对 Pyk2 免疫荧光染色的影响选题时间 2014.1 完成时间 2014.5论文（设计）字数9360关 键 词 固定方法， Pyk2，小鼠胚胎细胞，免疫荧光染色论文（设计）题目的来源、理论和实践意义：题目来源：实验室课题理论和实践意义：本文是以正常的雌性小鼠为研究对象，通过不同的染色前固定和透膜方法，。

5、免疫荧光技术的实验方法及其分类一、免疫标记法及其分类 1.荧光免疫法 原理是应用一对单克隆抗体的夹心法。底物用磷酸-4-甲基伞形酮，检测产物发出的荧光，荧光强度与 Mb 浓度呈正比，可在8min内得出结果。结果以 Mb 每小时释放的速率表示(Mb)表示。该法重复性好，线性范围宽，具有快速、敏感、准确的特点。 以双抗夹心法为例，首先将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体。除去未结合抗体，然后加受检标本，使其中的蛋白抗原与固相抗体形成抗原抗体复合物。洗涤除去未结合物，接着加入荧光标记的抗体，使之与抗原特异性结合，形成抗体。

6、免疫荧光单标记和双标记的方法l 免疫荧光单标记方法免疫荧光单标记是指只标记一种蛋白质分子，方法比较简单，只要按照染色步骤去做，通常不存在太多的问题。但要注意固定液的选择，固定液选择的合适与否，可能会直接影响染色结果。具体染色方法如下。1)所需材料与试剂(1)培养在盖玻片或玻璃培养皿中融合程度达到 60一 70的细胞。(2)一抗、FITC 或 TRITC 标记的二抗。(3)4多聚甲醛固定液或冷丙酮固定液(一 20预冷 20min)。(4)封闭液。(5)001mol LPBS 缓冲液。2)染色方法(1)取出培养有细胞的盖玻片或 glassbottom 培养皿，用 001MPBS 洗 23 。

7、组织切片免疫荧光染色的具体步骤1 直接免疫荧光法的操作步骤标本的处理：石蜡切片经脱蜡、梯度酒精脱水后，进行抗原修复，然后用 0.01M PBST 漂洗 5min 3/次； 2%BSA 或 10%BSA 37 C 湿盒内封闭 30min 抗体染色：C 孵育 30min； 在标本片上滴加适当稀释的荧光标记抗体(1:8 或 1:16 稀释) ，放在湿盒中，37 0.0lmol/L PBS(pH 7.4) 漂洗 5min 3/次，不时震荡(洗去多余游离的荧光素标记的抗体 )。 缓冲甘油封片 分析纯无荧光的甘油 9 份+ pH 9.2，0.2M 碳酸盐缓冲液 1 份配制。 镜检：在荧光显微镜下观察。 优点：方法简便、特异性高，非特异。

8、实验室方法 作者单位 南京军区南京总医院 全军肾脏病研究所 ( 南京 ， 210002)? 2011 年版权归 肾脏病与透析肾移植杂志 编辑部所有肾组织石蜡切片免疫荧光染色的新方法张明超 郑春霞 黄 倩 马 怡 王伟伟 曾彩虹摘 要 目的 : 探讨高温修复联合酶消化法在肾组织石蜡切片进行免疫荧光染色及其在病理诊断中应用的可行性 。 方法 : 选取南京军区南京总医院全军肾脏病研究所经肾活检明确诊断为肾小球疾病的患者 : 狼疮性肾炎 、抗肾小球基膜肾炎 、致密物沉积病 、轻链沉积病 ( ) 及淀粉样变性 ( ) 各 4 例 ， 感染后肾小球肾炎 、膜性肾病及膜。

9、免疫荧光非特异性染色的消除方法 一、非特异性染色的主要因素 组织的非特异性染色的机理很复杂，其产生的原因主要可分为以下几点：（1）一部分荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去。（2）抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分结合。（3）除去检查的抗原以外，组织中还可能存在类属抗原（如 Forssman 氏抗原），可与组织中特异性抗原以外之之相应抗体结合。（4）从组织中难于提纯抗原性物质，所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗其他组织成分的抗体，以致容易混淆。（5）抗体分子上标。

10、石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法1、组织的采集、固定和保存：采取组织后，方法一：4%多聚甲醛（4%PFA）4C 固定 1 小时（根据组织大小和致密程度调整固定时间）或过夜方法二：采用 bouins 固定 RT 2h（6-8d tesis）or RT 过夜（成年 tesis）PBS 缓冲液洗三次，每次 5min，4C 保存于 70%乙醇中。2、组织的包埋、切片、展片及保存：固定后的样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，52-54C 石蜡包埋，常规切片，切片厚 4 -10m，贴于处 理过的干净载玻片上，37 C 烤片过夜，之后收集于载片盒中， RT 密封保存。石蜡包埋：保存于 4C 70%乙醇中的组。

11、制备细胞爬片1、在无菌培养皿或 6 孔细胞培养板中铺上灭菌后的盖玻片，在每片盖玻片上滴一滴计数后的细胞悬液（细胞密度为2105/ml） 。再在每片盖玻片上滴加培养液至刚好覆盖满盖玻片。将培养皿（6 孔细胞培养板）置于 37，含 5% CO2 及饱和湿度的 CO2 培养箱中培养。2、4 小时后将培养液加量至覆盖整个培养皿的底面。 3、倒置显微镜下观察，当细胞增殖到合适的密度后取出培养皿中止培养（一般为 1-3 天） 。 4、倾去培养液，加 PBS（PH 7.27.4）洗涤细胞爬片 2 次，每次 1 min。5、加 10%中性多聚甲醛（或 -20预冷的丙酮）固定 1015min。。

12、 免疫荧光染色的质量控制 单细胞悬液荧光染色关系着流式分析的精度，应特别注意染料的特性及量效关系，由于免疫荧光染色中还涉及抗体特异性及小家问题，应严格按照实验操作的要求进行。1 温度对荧光染色的影响环境温度的升高对荧光染色有明显的影响，可使溶液的粘滞性增加，荧光染料分子的动力增大，荧光淬灭的可能性增大，荧光分子的光子产量降低。如保持温度在 20以下，光子产量的变化。

13、免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光，下文主要列举了三种细胞免疫荧光染色的实验步骤。zo-1 的免疫荧光，步骤如下：1、细胞在盖片上生长融合到 95%-100%时，从孵箱中取出。2、用预温的 1PBS 洗 3 次，每次 10 分钟3、4% 的甲醛室温固定 20-30 分钟4、1PBS 洗 3 次，每次 10 分钟5、0.2%Triton X-100 透化 2-5 分钟6、1PBS 洗 3 次，每次 10 分钟7、5% BSA 室温封闭 30 分钟8、加一抗(用 1%BSA 稀释) 放在。

14、对于石蜡切片：1、烤片：60 60 分钟2、脱蜡：二甲苯中脱蜡 15分钟二甲苯脱蜡 15分钟无水乙醇5 分钟无水乙醇5 分钟90%乙醇5 分钟90%乙醇5 分钟70乙醇 5分钟蒸馏水 5分钟蒸馏水 5分钟。3、抗原修复：高压修复，事先烧开锅中的水，修复盒中加入 0.01mol/l柠檬酸钠，pH6.0(柠檬酸三钠 3g,柠檬酸 0.4g 加入 1000ml蒸馏水中)，上汽后加热10分钟，关火。修复盒取出，放入装有自来水的瓷缸中缓慢冷却至室温。 2. 去除内源性酶：玻片取出放入湿盒，加 3%H2O22 (2ml H2O22 加入 18ml蒸馏水中，现配现用，避光)，室温孵育 10分钟，PBS 洗 3次，每次 5。

15、免疫荧光染色方法 （一）制片 选无自发性荧光的石英玻片或普通优质玻片，洗净后浸泡于无水乙醇和乙醚等量混合液中。用时取出用绸布擦净。将待检样品如组织块剪成适当大小印压于玻片上。也可采用冰冻切片或石蜡切片样品。（二）固定除研究细胞表面抗原或不稳定抗原可不固定外，一般均应固定。固定的作用有三：防止标本从玻片上脱落；除去防碍抗原抗体结合的类脂，使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果；固定的标本易于保存，如组织切片固定后在-20下可保存一年而不改变其染色特性。标本的固定原则是：不能损伤细胞内的抗原；不能凝集蛋。

16、免疫荧光细胞化学染色方法一、标本制作可制作涂片、印片、细胞单层培养物、组织切片，经适当固定或不固定，作免疫荧光染色用。二、荧光抗体染色方法（一）直接法1染色 切片经固定后，滴加经稀释至染色效价如 1：8 或 1：16 的荧光抗体（如兔抗人 -球蛋白荧光抗体或兔抗人 IgG 或 IgA 荧光抗体等），在室温或 37染色 30min，切片置入能保持潮湿的染色盒内，防止干燥。2洗片 倾去存留的荧光抗体，将切片浸入 pH7.4 或 pH7.2PBS 中洗两次，搅拌，每次 5min，再用蒸馏水洗 1min，除去盐结晶。3用 50%缓冲（0.5mol/L 碳酸盐缓冲液 pH9.09.5）甘。

17、不通透的染色方法: 封闭液:3%BSA 用 PBS 配制不加吐温-20,一抗,二抗用封闭液配制.1. 4% PFA（多聚甲醛）室温 固定 15min。2. 1xPBS 洗三次，每次 5min。3. 3%BSA（不加吐温-20）封闭 1hr。 4. 一抗 4 度过夜5. 1xPBS 洗三次，每次 5min。6. 二抗 37 度 2hr。 7. 1xPBS 洗三次，每次 5min。8. DAPI 染色 5min。9. 1xPBS 洗三次，每次 5min。蔺红方法染色：蔺红用的方法封闭液里不加土温 20 。我们模拟这个方法封闭液里加了土温 20。1. 4% PFA（多聚甲醛） 固定 15min。2. 1xPBS 洗三次，每次 5min。3. 0.2% tritonX-100 通透 15min。4. 1xP。