1、免疫荧光细胞化学染色方法一、标本制作可制作涂片、印片、细胞单层培养物、组织切片，经适当固定或不固定，作免疫荧光染色用。二、荧光抗体染色方法（一）直接法1染色 切片经固定后，滴加经稀释至染色效价如 1：8 或 1：16 的荧光抗体（如兔抗人 -球蛋白荧光抗体或兔抗人 IgG 或 IgA 荧光抗体等），在室温或 37染色 30min，切片置入能保持潮湿的染色盒内，防止干燥。2洗片 倾去存留的荧光抗体，将切片浸入 pH7.4 或 pH7.2PBS 中洗两次，搅拌，每次 5min，再用蒸馏水洗 1min，除去盐结晶。3用 50%缓冲（0.5mol/L 碳酸盐缓冲液 pH9.09.5）甘油封固、镜检4对
2、照染色正常免荧光血清染色，如上法处理切片，结果应为阴性。染色抑制试验（一步法）：将荧光抗体和未标记的抗体球蛋白或血清（相同）等量混合，如上法处理切片。结果应为阴性。为证明此种染色抑制不是由于荧光抗体被稀释所致，可用盐水代替未标记抗血清，染色结果应为阳性。此法结果较二步法稳定。类属抗原染色试验，前面已作叙述。直接法比较简单，适合做细菌、螺旋体、原虫、真菌及浓度较高的蛋白质抗原如肾、皮肤的检查和研究。此法每种荧光抗体只能检查一种相应的抗原，特异性高而敏感性较低。（二）间接法（1）切片固定后用毛细滴管吸取经适当稀释的免疫血清滴加在其上，置于染色盒中保持一定的湿度，37作用 30min。然后用 0.0
3、1mol/l pH7.2PBS 洗两次，10min，用吸水吸去或吹干余留的液体。（2）再滴加间接荧光抗体（如兔抗人 -球蛋白荧光抗体等），同上步骤，染色 30min，37，缓冲盐水洗两次 10min，搅拌，缓冲甘油封固，镜检。对照染色：抗体对照：用正常兔血清或人血清代替免疫血清，再用上法进行染色，结果应为阴性。抗原对照：即类属抗原染色，亦应为阴性。阳性对照。间接法中上述方法称双层法（Double Layer Method）。另一种称夹心法，即用未标记的特异性抗原加在切片上先与组织中之相应抗体结合，再用该抗原之荧光抗体重叠结合其上，而间接地显示出组织和细胞中抗体的存在，方法步骤如下：切片或涂片固
4、定后，置于染色湿盒内。滴加未标记的特异性抗原作用切片于 37，30min。缓冲盐水洗 2 次，每次 5min，吹干。滴加特异性荧光抗体再用切片于 37，30min。如水洗。缓冲甘油封固，镜检。间接法只需制备一种荧光抗体可以检出多种抗原，敏感性较高，操作方法较易掌握，而且能解决一些不易制备动物免疫血清的病原体（如麻疹）等的研究和检查，所以已被广泛应用于自身抗体和感染病人血清的试验。（三）补体法1材料（1）免疫血清 60灭活 20min，用 Kolmers 盐水作 2 倍稀释成 1：2，1：4，1：8。补体用 1：10 稀释的新鲜豚鼠血清，抗补体荧光抗体等，按下述的补体法染色。免疫血清补体结合的效
5、价，如为 1：32 则免疫血清应作 1：8 稀释。（2）补体用新鲜豚鼠血清一般作 1：10 稀释或按补体结合反应试管法所测定的结果，按 2 单位的比例，用 Kolmers 盐水稀释备用。 Kolmers 盐水配法：即在 pH7.4、0.1mol/L 的磷酸缓冲盐水中，溶解 MgSO4 的含量为 0.01%浓度。（3）抗补体荧光抗体：在免疫血清效价为 1：4，补体为 2 单位的条件下，用补体染色法测定免疫豚鼠球蛋白荧光抗体的染色效价，然后按染色效价 1：4 的浓度用 Kolmers 盐水稀释备用。2方法步骤（1）涂片或切片固定。（2）吸取经适当稀释之免疫血清及补体之等量混合液（此时免疫血清及补体
6、又都稀释一倍）滴于切片上，37作用 30min，置于保持一定湿度的染色盒内。（3）用缓冲盐水洗 2 次，搅拌，每次 5min，吸干标本周围水液。（4）滴加经过适当稀释之抗补体荧光抗体 30min，37，水洗同（3）。（5）蒸馏水洗 1min，缓冲甘油封固。3对照染色（1）抗原对照。（2）抗血清对照：用正常兔血清代替免疫血清。（3）灭活补体对照：将补体经 5630min 处理后，按补体同样比例稀释，与免疫血清等量混合后，进行补体法染色。本法之荧光抗体不受免疫血清的动物种属的限制，因而一种荧光抗体可作更广泛的应用，敏感性亦较间接法高，效价低的免疫血清亦可应用，节 省免疫血清，尤其是对检查形态小的如
7、立克氏体、病毒颗粒等或浓度较低的抗原物质时甚为理想。（四）膜抗原荧光抗体染色法本法应用直接法或间接法的原理和步骤，可对活细胞在试管内进行染色，常用于 T 和 B 细胞、细胞培养物、瘤细胞抗原和受体等的检查和研究，阳性荧光主要在细胞膜上。FACS 即采用此法原理。（五）双重染色法在同一标本上有两个抗原需要同时显示（如 A 抗原和 B 抗原），A 抗原的抗体用 FITC 标记，B 抗原的抗体用罗达明标记，可采用以下染色方法：1一步法双染色 先将两种标记抗体按适当比例混合（A+B），按直接法进行染色。2二步法双染色 先用 RB200 标记的 B 抗体染色，不必洗去，再用 FITC 标记的 A 抗体染
8、色，按间接法进行。结果：A 抗原阳性荧光呈现绿色，B 抗原阳性呈现桔红色荧光。（六）荧光抗体再染色法若切片或其他标本经某种荧光抗体染色后，未获得阳性结果，而又疑有另外的病原体存在时，可用相应的荧光抗体再染色。有时存档蜡块不能再用以切片，也可用存档的 HE 染色标本，褪去盖片和颜色，再作免疫荧光或其它免疫细胞化学的染色。三、荧光抗原染色法某些抗原可以用荧光素标记，制成荧光抗原，标记荧光素的方法与制备荧光抗体方法相同。用荧光抗原可以直接检查细胞或组织内的相应抗体，特异性较好，敏感性较差。染色方法同荧光抗体染色的直接法。由于多数抗原难以提纯或量少不昂贵，一般很少采用此法。.免疫荧光非特异性染色的消除
9、方法一、非特异性染色的主要因素 组织的非特异性染色的机理很复杂，其产生的原因主要可分为以下几点：（1）一部分荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去。（2）抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分结合。（3）除去检查的抗原以外，组织中还可能存在类属抗原（如 Forssman 氏抗原），可与组织中特异性抗原以外之之相应抗体结合。（4）从组织中难于提纯抗原性物质，所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗其他组织成分的抗体，以致容易混淆。（5）抗体分子上标记的荧光素分子太多，这种过量标记的抗体分子带过多的阴离子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色。（6）荧光素不纯
10、，标本固定不当等。二、消除非特异性染色的方法消除荧光抗体非特异性染色的方法应根据产生的原因采取适当的方法，常用的方法有以下几种：（一）动物脏器粉末吸收法常用肝粉（猪、大白鼠或小白鼠），其次是骨髓粉、鼠脑粉和鸡胚粉等。每毫升荧光抗体中加入肝粉50100mg,在离心管中充分混匀，在室温中振动 2h，4中过夜，再搅拌 10min，高速离心（300015000r/min）30min，12 次后，即可使用其上清液。吸收一般应在临用前进行，吸收后之荧光抗体保存冰箱中勿超过 2 周。染色应作吸收前后之比较，吸收时可先用缓冲盐水将组织干粉浸湿，离心（300015000r/min）30min，除去上清液，再加入
11、荧光抗体进行吸收，以免消耗过多的抗体。肝粉或新鲜细胞吸收是一种非特异性的消除方法，对荧光抗体的荧光色素和蛋白都有吸附作用。如检查组织中的病毒抗原时，也可用相同的组织干粉或匀浆沉淀物吸收之。用脏器肝粉吸收对荧光抗体损失较多，如果根据 Hiramotos 氏等的方法将组织的 20%生理盐水匀浆液，用生理盐水洗 23 次，12000r/min 10min 离心沉淀，用其沉淀物吸收其荧光抗体即能完全达到目的，京极方久氏认为这样吸收对荧光抗体几乎没有损失，他们常用此法，效果甚佳，吸收后放置一周左右，用时有必要再吸收一次。【肝粉的制法】（1）将若干只小白鼠或大白鼠放血杀死，取出肝脏，用生理盐水洗 23 次
12、，除去血液，剥掉表面的结缔组织的脂肪。（2）剪碎，用生理盐水反复洗涤至无血色止，然后再加生理盐水少许，用组织捣碎机或匀浆器作成匀浆。（3）将肝匀浆装入离心管内（1/3 左右），交换地用 23 倍量生理盐水和丙酮反复洗涤各三次，至上清无血色止，每次完毕先用 2000r/min 离心沉淀 15min 后，再除去上清液。（4）最后用丙酮洗涤肝浆，再用布氏漏斗过滤，或离心沉淀，将沉淀物平铺在洁净的玻璃板上，37烤干（过夜）。（5）在乳钵中充分研磨，用 120 目铜筛筛选过后，分装，密封，低温干燥保存。（二）透析法荧光素如 FITC 分子可以通过半透膜，而蛋白质大分子不能透过，可将未与蛋白结合的荧光素透
13、析除去。（1）将标记完毕的荧光蛋白液装入一透析袋或玻璃纸袋内，液面稍留空隙，紧扎。（2）浸入 0.02mol/ph 7.17.4 的 PBS 中（悬于大于标记物体积约 50100 倍的 PBS 内），在 4中透析，每日更换 34 次 PBS，约 57 天，透析液中无荧即可（在荧光光源照射下）。（三）葡聚糖凝胶 G-50 柱层析法除游离荧光素可用 246cm 柱层析法，详细方法参阅第二章 。加入荧光抗体 1518ml（按床体积的 5%10% 加样），使其缓慢渗入柱内，待即将全部入柱时，加入 PBS 少许，关闭下口，停留 3040min ，使游离荧光充分进入细筛孔中，然后再接通洗脱瓶开始滴入洗脱液
14、。加入洗脱液一定量后，荧光抗体即向下移行，逐渐与存留于上端的游离荧光素之间拉开明显的界线，随着大量洗脱液的不断加入，二者分离距离越来越大，荧光抗体最先流出，分前、中、后三部分收集，测 F/P 比值，合格者合并，浓缩，分装。洗脱液用 20%磺基水杨酸测定蛋白（发生沉淀反应），继续洗脱，游离荧光素则相继被洗脱下来，至洗脱液中无蛋白和荧光素后，此层析柱即可再用。若用以除去荧光抗体中的游离荧光素和硫酸铵等盐类，可先在过柱前透析一夜，否则，NH4+太浓，在蛋白未完全洗脱时即出现 NH4+，因而影响提纯与回收蛋白，一般待洗脱液出现蛋白时，即进行收集，之后出现 SO4+（用 1%BaCl2 检查发生白色沉淀
15、）。最后是 NH4+，（用纳氏试剂检查呈黄棕色沉淀），待洗脱液无 SO4+及 NH4+后可再用。如仅用小量荧光抗体，可用 120cm 的柱层析柱，取 2g Sephadex G-50 装柱，即可过滤 23.5ml 荧光抗体。（四）DEAE 纤维素柱层析法标记过多或过少荧光素的抗体分子可用 DEAE-纤维素柱层析法除去。方法如下：DEAE- 纤维素柱的装柱，洗脱、再生方法等与提纯 IgG 方法相同。装柱所需 DEAE-纤维素量以干重每克交换 2050mg 标记蛋白量为宜。常用梯度洗脱法如下：（1）层析柱用 0.01mol/L、pH7.2PB 平衡，标记物上柱后，先用 0.01mol/L、pH7.
16、2PB 洗脱，洗出无色或淡绿色液体，洗脱液量（根据床体积大小每梯度乘 3），然后依下列各种离子强度洗脱液，分别洗脱和收集：0.01mol/L、pH7.2PBS（0.05mol/l NaCl）洗脱部分 1。0.01mol/L、pH7.2PBS（0.01mol/l NaCl）洗脱部分 2。0.01mol/L、pH7.2PBS（0.02mol/l NaCl）洗脱部分 3。将此三部分收集液（每管 5ml）分别测定其 F/P 比值，0.05mol/l NaCl pH7.2PB 洗脱液 280nm 光密度高峰管合并，浓缩保存备用。因这部分非特异性染色荧光最少，是比较好的荧光抗体。其他两部分可以废弃。（2）
17、柱上吸附的过度标记蛋白可继续增加 NaCl 的浓度至 2.0mol/L 洗脱完。经过 DEAE-纤维素层析后的标记抗体，其抗体量一般约损失 50%，因此有些要求不太高的抗体，如抗细菌荧光抗体，不一定要这样处理，可用染色效价测定的稀释法除去非特异性染色。（五）荧光抗体稀释法先测定荧光抗体特异性染色与非特异性染色的效价，若二者效价相差较大，则可将荧光抗体稀释至一临界浓度，使特异性染色呈阳性，而使非特异性染色保持阴性，稀释方法和染色效价测定方法相同。（六）纯化抗原法用各种方法提纯单一成分的抗原是产生单价特异性抗体的最主要条件。近代免疫化学技术（免疫吸收法）和柱层析法等提供了很大的可能性，可参考有关专
18、著。（七）纯化抗体法-免疫吸收法例如抗 IgA 血清的纯化方法-免疫吸收法。如分泌型 IgA（SIgA）抗原纯度不高，所制的抗血清常与IgG 呈交叉反应，为此需要吸收，常采用纯化的人 IgG 戊二醛聚合物加以吸收纯化。方法如下：1人 IgG 聚合物的制备 在 5ml 含 40mg/ml 人 IgG 的 0.1mol/l pH7.0 磷酸缓冲溶液中，加入 2.5%戊二醛溶液 1ml，边加边搅，5min 即出现混浊，逐现大块胶块，放置 30min 后，用研钵将凝胶磨细，继用 1.0mol/l pH7.0 磷酸缓冲溶液反复洗涤 3 次，末次加蒸馏水至 20ml，即为人 IgG 聚合物悬液。2免疫吸收
19、法 将待吸收的抗 SIgG 血清加入待量 IgG 聚合物悬液，置室温搅拌 60min,离心沉淀，上清液即稀释 1 倍的纯化抗 SIgA 血清。如用 IgG 聚合物作少量分次吸收，其效果更好。（八）伊文氏蓝（Evans blue）衬染法用 0.01%伊文氏蓝的 0.01mol/l pH7.2PBS 稀释荧光抗体，可将背景细胞和组织染色，呈红色荧光，与特异性黄绿色荧光形成鲜明的对比，减少了非特异性荧光，宜作常规应用。伊文氏蓝一般先配成 1%溶液，保存于 4，用前再稀释至 0.01%用以和然释荧光抗体。此外，还可以用胰酶消化组织切片或用 10%牛血清蛋白封闭法等消除非特异性染色，提高特异性染色。需要相关抗体试剂的可以访问 Fantibody 全球抗体搜索引擎：http:/ 全球抗体搜索引擎是一个供公共检索的抗体数据库，其抗体信息数据来源于全球范围的研究机构与商业公司。该引擎由商品化抗体数据库与抗体应用评价数据库两部分组成，以帮助研究者更高效的寻找并评估该抗体的性能。全球抗体搜索引擎是继基因与蛋白数据库之后更为复杂的应用型检索平台，由探生科技建立并维护。需要相关的实验室仪器设备、生物试剂、医疗器械、制药设备、医药原料、体外诊断试剂及耗材与技术服务信息的，可以访问探生网进行咨询：http:/
