1、对于石蜡切片：1、烤片：60 60 分钟2、脱蜡：二甲苯中脱蜡 15分钟二甲苯脱蜡 15分钟无水乙醇5 分钟无水乙醇5 分钟90%乙醇5 分钟90%乙醇5 分钟70乙醇 5分钟蒸馏水 5分钟蒸馏水 5分钟。3、抗原修复：高压修复，事先烧开锅中的水，修复盒中加入 0.01mol/l柠檬酸钠，pH6.0(柠檬酸三钠 3g,柠檬酸 0.4g 加入 1000ml蒸馏水中)，上汽后加热10分钟，关火。修复盒取出，放入装有自来水的瓷缸中缓慢冷却至室温。 2. 去除内源性酶：玻片取出放入湿盒，加 3%H2O22 (2ml H2O22 加入 18ml蒸馏水中，现配现用，避光)，室温孵育 10分钟，PBS 洗
2、3次，每次 5分钟。 （也可不用去除内源性酶） 。3. 封闭(Blocking) 加 10%正常驴血清（原液 100ul+900ulPBS,1ml够用 30张片子） ，室温孵育封闭 30分钟。如果背景较高，可以 4封闭过夜。不用洗，用滤纸吸干周边水分。 从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。 4. 一抗孵育(Primary antibody incubation) 参考一抗的说明书，按照适当比例用免疫染色一抗稀释液（10%山羊血清PBS或 1%BSA-PBS）稀释一抗。 立即加入稀释好的一抗， 4过夜，第二天取出复温 45分钟。PBS 洗 3次，每
3、次 5分钟。 5. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation) 按照适当比例用免疫荧光染色二抗稀释液稀释荧光标记的二抗，立即加入稀释好的二抗，室温或 4在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。 PBS洗涤 3次。每次 5分钟。如果结果背景较高，可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。 6. 蛋白检测(Detection of proteins) 对于免疫荧光染色，此时已经可以直接到荧光显微镜下观察。 7. 复染用 DAPI对细胞核进行染色，室温 10分钟，PBS 冲洗 5分钟3 次，封片（封片剂或分析纯的甘油与 0.5molpH9.5碳酸缓冲液 1：1 混合）显微镜观察，染色后为蓝色荧光。多重荧光染色：可使用红色荧光、绿色荧光和蓝色荧光进行三重荧光染色。例如用 免疫荧光染色试剂盒-抗小鼠 Cy3(P0193)进行红色荧光染色，随后可以用 免疫荧光染色试剂盒-抗兔 FITC(P0186)进行绿色荧光染色，在完成上述两种染色后可以使用 Hoechst染色试剂盒(C0003)对细胞核进行染色，染色后为蓝色荧光。 0.5molpH9.5碳酸缓冲液配方：NaHCO3 3.7gNa2CO3 0.6g双蒸水溶解至 100ml，调节 pH至 9.5
