1、制备细胞爬片1、在无菌培养皿或 6 孔细胞培养板中铺上灭菌后的盖玻片，在每片盖玻片上滴一滴计数后的细胞悬液（细胞密度为2105/ml） 。再在每片盖玻片上滴加培养液至刚好覆盖满盖玻片。将培养皿（6 孔细胞培养板）置于 37，含 5% CO2 及饱和湿度的 CO2 培养箱中培养。2、4 小时后将培养液加量至覆盖整个培养皿的底面。 3、倒置显微镜下观察，当细胞增殖到合适的密度后取出培养皿中止培养（一般为 1-3 天） 。 4、倾去培养液，加 PBS（PH 7.27.4）洗涤细胞爬片 2 次，每次 1 min。5、加 10%中性多聚甲醛（或 -20预冷的丙酮）固定 1015min。6、吸除固定液，加
2、 PBS 再洗涤细胞爬片 3 次，每次 5 min。7、置于室温下干燥 1 小时，如暂不染色，先放在-20 冰箱中保存。8、取出盖玻片时注意盖玻片的正反面（有细胞的为正面） 。将硅化玻片放入饭盒（金属） ，排好顺序，一定要放平，消毒，将消化好的细胞滴在硅化玻片上，可一片滴两滴，放入培养箱 2 小时，待细胞贴片，2小时后取出加培液至没过玻片，放培养箱过夜，取出后即丙酮固定，偶做过，效果不错的。免疫荧光双染用两个不同的物种的原始抗体的双免疫荧光染色基本方案1) 冰冻切片，晾干，4%多聚甲醛固定 1015min。 （细胞爬片固定后，以下步骤一样）2) 漂洗和稀释：在 10 mM 磷酸钠缓冲液，pH7
3、.5，150mM NaCl（PBS）中漂洗切片，3 5 分钟。PBS 液是用来漂洗和稀释的。其他缓冲液如 Tris 缓冲碱（TBS）也可用。3) 在细胞爬片上加 0.03%-1% Triton X-100 溶液处理 15min。 （若是要检测的抗原表达于胞膜，此步可考虑省略） ，PBS 液洗 35 分钟4) 阻断步骤：用含 5%的正常二度抗体物种来源血清的 PBS 孵化切片 60 分钟。（37 ） （一抗前不洗，只甩干）5) 原始抗体：在切片上吸干多余的阻断液，在室温下孵化 60 分钟或在 4下相应地用稀释的两个物种（如鼠和兔）的未标记的一度抗体混合一起孵化过夜。当用荧光标记的原始抗体用于直接
4、免疫染色（一度抗体）时，你可以跳过用二度抗体的间接免疫染色方法（二度抗体）的步骤（6） 。 （4过夜最好）在 PBS 液或 TBS 中漂洗 35 分钟。6) 二度抗体：用一对不同荧光素标记的二度抗体，用以结合相应物种原始抗体的 IgG，在室温下孵化切片 60 分钟，在 PBS 中漂洗 35 分钟。7) 复染：如果必要进行核染色如用 DAPI（5 g/ml PBS 中 5min） 。在 PBS 中漂洗切片 35 分钟。8) 选择性：为了阻止荧光标记从抗体上脱离，也为了更长的保存以保护染色，在水溶性媒介使用前，推荐在含 4%甲醛的 PBS 液中简短的处理（ 1-3 分钟）。在 PBS 中漂洗切片
5、23 分钟。9) 锚定：对于荧光显微镜，用抗褪色媒介锚定切片。注释：一般来说，两种二度抗体来自同一物种进行双/多标记当用生物素标记的二度抗体时，在进行复染色（步骤 7）前，应首先用荧光标记的（链）亲和素的 ABC 技术（见 6.2.1 章节）来观察生物素。细胞爬片的免疫化学染色法 （DAB 染色）1、在细胞爬片上加 0.03% Triton X-100 水溶液处理 15min。 （若是要检测的抗原表达于胞膜，此步可考虑省略）2、 吸除 0.03% Triton X-100，加 3%H2O2 孵育 10min。3、 吸除 3%H2O2，加 2%牛血清白蛋白封闭 3060min 。PBS 洗 5m
6、in。4、 吸除 PBS，分别滴加相应的一抗（用含 1%牛血清白蛋白的PBS 液稀释到合适滴度） ，置于 37孵育 1h，或置于 4冰箱中过夜。阴性对照片此步用 PBS 替代一抗。5、 吸去一抗，PBS 漂洗 3 次，每次 5min。滴加山羊抗鼠的IgG 抗体-fitc 多聚体，37孵育 30min。 6、 PBS 漂洗 3 次，每次 5min。新鲜配制 DAB 显色液，滴加后作用 35min，置于显微镜下观察染色结果。7、 双蒸水漂洗后，滴加苏木精染液，染色 10min。(1-2 分钟就够了染得太浅要再染!)8、 双蒸水漂洗后，滴加 0.5%HCl-70%Ethanol（乙醇） ，作用1min 以分色。9、 双蒸水漂洗后，滴加 1%NaHCO3 作用 35min 以蓝化细胞核。10、双蒸水漂洗 1min，然后将细胞爬片经70%、 80%、95%、100%、100% 乙醇 各 12min 梯度脱水。11、入二甲苯透明 2 次，每次 5min。(可以 1-2 分钟)12、室温下晾干，用中性树胶封片。13、显微镜下观察染色结果，并拍照。
