1、免疫荧光非特异性染色的消除方法 一、非特异性染色的主要因素 组织的非特异性染色的机理很复杂，其产生的原因主要可分为以下几点：（1）一部分荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去。（2）抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分结合。（3）除去检查的抗原以外，组织中还可能存在类属抗原（如 Forssman 氏抗原），可与组织中特异性抗原以外之之相应抗体结合。（4）从组织中难于提纯抗原性物质，所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗其他组织成分的抗体，以致容易混淆。（5）抗体分子上标记的荧光素分子太多，这种过量标记的抗体分子带过多的阴离子，可吸附于正常组织上而呈现非
2、特异性染色。（6）荧光素不纯，标本固定不当等。二、消除非特异性染色的方法消除荧光抗体非特异性染色的方法应根据产生的原因采取适当的方法，常用的方法有以下几种：（一）动物脏器粉末吸收法常用肝粉（猪、大白鼠或小白鼠），其次是骨髓粉、鼠脑粉和鸡胚粉等。每毫升荧光抗体中加入肝粉50100mg,在离心管中充分混匀，在室温中振动 2h，4中过夜，再搅拌 10min，高速离心（300015000r/min）30min，12 次后，即可使用其上清液。吸收一般应在临用前进行，吸收后之荧光抗体保存冰箱中勿超过 2 周。染色应作吸收前后之比较，吸收时可先用缓冲盐水将组织干粉浸湿，离心（300015000r/min）3
3、0min，除去上清液，再加入荧光抗体进行吸收，以免消耗过多的抗体。肝粉或新鲜细胞吸收是一种非特异性的消除方法，对荧光抗体的荧光色素和蛋白都有吸附作用。如检查组织中的病毒抗原时，也可用相同的组织干粉或匀浆沉淀物吸收之。用脏器肝粉吸收对荧光抗体损失较多，如果根据 Hiramotos 氏等的方法将组织的 20%生理盐水匀浆液，用生理盐水洗 23 次，12000r/min 10min 离心沉淀，用其沉淀物吸收其荧光抗体即能完全达到目的，京极方久氏认为这样吸收对荧光抗体几乎没有损失，他们常用此法，效果甚佳，吸收后放置一周左右，用时有必要再吸收一次。【肝粉的制法】（1）将若干只小白鼠或大白鼠放血杀死，取出
4、肝脏，用生理盐水洗 23 次，除去血液，剥掉表面的结缔组织的脂肪。（2）剪碎，用生理盐水反复洗涤至无血色止，然后再加生理盐水少许，用组织捣碎机或匀浆器作成匀浆。（3）将肝匀浆装入离心管内（1/3 左右），交换地用 23 倍量生理盐水和丙酮反复洗涤各三次，至上清无血色止，每次完毕先用 2000r/min 离心沉淀 15min 后，再除去上清液。（4）最后用丙酮洗涤肝浆，再用布氏漏斗过滤，或离心沉淀，将沉淀物平铺在洁净的玻璃板上，37烤干（过夜）。（5）在乳钵中充分研磨，用 120 目铜筛筛选过后，分装，密封，低温干燥保存。（二）透析法荧光素如 FITC 分子可以通过半透膜，而蛋白质大分子不能透过
5、，可将未与蛋白结合的荧光素透析除去。（1）将标记完毕的荧光蛋白液装入一透析袋或玻璃纸袋内，液面稍留空隙，紧扎。（2）浸入 0.02mol/ph 7.1 7.4 的 PBS 中（悬于大于标记物体积约 50100 倍的 PBS 内），在 4中透析，每日更换 34 次 PBS，约 57 天，透析液中无荧即可（在荧光光源照射下）。（三）葡聚糖凝胶 G-50 柱层析法除游离荧光素可用 246cm 柱层析法，详细方法参阅第二章 。加入荧光抗体 1518ml（按床体积的 5%10%加样），使其缓慢渗入柱内，待即将全部入柱时，加入 PBS 少许，关闭下口，停留3040min ，使游离荧光充分进入细筛孔中，然后
6、再接通洗脱瓶开始滴入洗脱液。加入洗脱液一定量后，荧光抗体即向下移行，逐渐与存留于上端的游离荧光素之间拉开明显的界线，随着大量洗脱液的不断加入，二者分离距离越来越大，荧光抗体最先流出，分前、中、后三部分收集，测 F/P 比值，合格者合并，浓缩，分装。洗脱液用 20%磺基水杨酸测定蛋白（发生沉淀反应），继续洗脱，游离荧光素则相继被洗脱下来，至洗脱液中无蛋白和荧光素后，此层析柱即可再用。若用以除去荧光抗体中的游离荧光素和硫酸铵等盐类，可先在过柱前透析一夜，否则，NH4+太浓，在蛋白未完全洗脱时即出现 NH4+，因而影响提纯与回收蛋白，一般待洗脱液出现蛋白时，即进行收集，之后出现 SO4+（用 1%B
7、aCl2 检查发生白色沉淀）。最后是 NH4+，（用纳氏试剂检查呈黄棕色沉淀），待洗脱液无 SO4+及 NH4+后可再用。如仅用小量荧光抗体，可用 120cm 的柱层析柱，取 2g Sephadex G-50 装柱，即可过滤 23.5ml荧光抗体。（四）DEAE 纤维素柱层析法标记过多或过少荧光素的抗体分子可用 DEAE-纤维素柱层析法除去。方法如下：DEAE- 纤维素柱的装柱，洗脱、再生方法等与提纯 IgG 方法相同。装柱所需 DEAE-纤维素量以干重每克交换 2050mg 标记蛋白量为宜。常用梯度洗脱法如下：（1）层析柱用 0.01mol/L、pH7.2PB 平衡，标记物上柱后，先用 0.
8、01mol/L、pH7.2PB 洗脱，洗出无色或淡绿色液体，洗脱液量（根据床体积大小每梯度乘 3），然后依下列各种离子强度洗脱液，分别洗脱和收集：0.01mol/L、pH7.2PBS（0.05mol/l NaCl）洗脱部分 1。0.01mol/L、pH7.2PBS（0.01mol/l NaCl）洗脱部分 2。0.01mol/L、pH7.2PBS（0.02mol/l NaCl）洗脱部分 3。将此三部分收集液（每管 5ml）分别测定其 F/P 比值，0.05mol/l NaCl pH7.2PB 洗脱液 280nm 光密度高峰管合并，浓缩保存备用。因这部分非特异性染色荧光最少，是比较好的荧光抗体。其
9、他两部分可以废弃。（2）柱上吸附的过度标记蛋白可继续增加 NaCl 的浓度至 2.0mol/L 洗脱完。经过 DEAE-纤维素层析后的标记抗体，其抗体量一般约损失 50%，因此有些要求不太高的抗体，如抗细菌荧光抗体，不一定要这样处理，可用染色效价测定的稀释法除去非特异性染色。（五）荧光抗体稀释法先测定荧光抗体特异性染色与非特异性染色的效价，若二者效价相差较大，则可将荧光抗体稀释至一临界浓度，使特异性染色呈阳性，而使非特异性染色保持阴性，稀释方法和染色效价测定方法相同。（六）纯化抗原法用各种方法提纯单一成分的抗原是产生单价特异性抗体的最主要条件。近代免疫化学技术（免疫吸收法）和柱层析法等提供了很
10、大的可能性，可参考有关专著。（七）纯化抗体法-免疫吸收法例如抗 IgA 血清的纯化方法-免疫吸收法。如分泌型 IgA（SIgA）抗原纯度不高，所制的抗血清常与IgG 呈交叉反应，为此需要吸收，常采用纯化的人 IgG 戊二醛聚合物加以吸收纯化。方法如下：1 人 IgG 聚合物的制备 在 5ml 含 40mg/ml 人 IgG 的 0.1mol/l pH7.0 磷酸缓冲溶液中，加入 2.5%戊二醛溶液 1ml，边加边搅，5min 即出现混浊，逐现大块胶块，放置 30min 后，用研钵将凝胶磨细，继用1.0mol/l pH7.0 磷酸缓冲溶液反复洗涤 3 次，末次加蒸馏水至 20ml，即为人 IgG
11、 聚合物悬液。2 免疫吸收法 将待吸收的抗 SIgG 血清加入待量 IgG 聚合物悬液，置室温搅拌 60min,离心沉淀，上清液即稀释 1 倍的纯化抗 SIgA 血清。如用 IgG 聚合物作少量分次吸收，其效果更好。（八）伊文氏蓝（Evans blue）衬染法用 0.01%伊文氏蓝的 0.01mol/l pH7.2PBS 稀释荧光抗体，可将背景细胞和组织染色，呈红色荧光，与特异性黄绿色荧光形成鲜明的对比，减少了非特异性荧光，宜作常规应用。伊文氏蓝一般先配成 1%溶液，保存于 4，用前再稀释至 0.01%用以和然释荧光抗体。此外，还可以用胰酶消化组织切片或用 10%牛血清蛋白封闭法等消除非特异性染色，提高特异性染色。
