1、本科毕业论文论文题目：不同固定方法对 Pyk2 免疫荧光染色的影响 学生姓名： 常新莲 学 号 ： 20100130845 专 业 ： 生物科学 指导教师： 孟小倩 学 院： 生命科学学院 2014 年 5 月 18 日毕业论文（设计）内容介绍论文（设计）题 目不同固定方法对 Pyk2 免疫荧光染色的影响选题时间 2014.1 完成时间 2014.5论文（设计）字数9360关 键 词 固定方法， Pyk2，小鼠胚胎细胞，免疫荧光染色论文（设计）题目的来源、理论和实践意义：题目来源：实验室课题理论和实践意义：本文是以正常的雌性小鼠为研究对象，通过不同的染色前固定和透膜方法，以观察小鼠二细胞胚胎内
2、 402 位点磷酸化了的 Pyk2 蛋白免疫荧光染色的检测情况，从而比较不同固定方法对蛋白 Pyk2 的影响。为以后检测 402 位点磷酸化了的 Pyk2 蛋白在小鼠胚胎细胞内的分布、特征、及其在小鼠胚胎发育过程中的功能的探究奠定基础。通过改进固定方法，提高酪氨酸激酶免疫荧光的染色效率。为以后对 Pyk2 蛋白的进一步研究打好基础。论文（设计）的主要内容及创新点： 本实验研究了不同的染色前固定和透膜方法对小鼠二细胞胚胎内 402 位点磷酸化了的Pyk2 蛋白免疫荧光染色情况的影响。本实验是利用技术对小免疫荧光组织化学技术，用激光扫描共聚焦显微镜进行装片观察，并对新的固定及透膜方法进行比较、分析
3、、总结。建立了适合本实验的固定方法为免疫荧光细胞化学技术的改进提供了新思路。附：论文（设计） 本人签名： 2014 年 5 月 18 日目 录1 引言 .21.1 超数排卵和小鼠早期胚胎发育 .21.2 Pyk2 蛋白 .31.3 卵母细胞固定和压片技术 .42 实验材料 .62. 1 实验动物 .62. 2 实验器材 .62. 3 实验药品 .62. 4 试剂配制 .62. 5 实验仪器 .73 实验方法 .73.1 超数排卵和小鼠早期胚胎的收集 .73.2 免疫荧光染色 .73.3 Pyk2 在小鼠早期胚胎的定位 .84 结果分析 .94.1Tyr-402 p-Pyk2 在小鼠早期胚胎中的
4、定位 .94.2不同固定方法对 Pyk2在小鼠2细胞期胚胎中的定位. .104.3实验分析. .11参考文献 .13致谢 .14不同固定方法对 Pyk2 免疫荧光染色的影响常新莲（山东师范大学 生命科学学院 济南 250014）摘 要: 探索有效的染色前固定胚胎细胞的方法, 以提高小鼠胚胎细胞免疫荧光染色的效率。采用2种不同的固定方法处理小鼠胚胎细胞: （1）用4%多聚甲醛( PFA)固定30分钟; （2）在固定液4%多聚甲醛( PFA)中加入0. 1% Triton X-100固定30分钟。经检测发现第二种方案免疫荧光染色的效率更好，可检测到更多的Pyk2蛋白定位在小鼠胚胎细胞接触面和皮层部
5、分。关键词:固定方法， Pyk2蛋白，小鼠胚胎细胞，免疫荧光染色The Different Effect of Pyk2 Immunofluorescence Staining with Two Fixation MethodsXinlian Chang（College of Life Science, Shandong Normal University , Jinan 250014)ABSTRACT： This experiment is trying to study the effective method of fixation of embryonic cells before s
6、taining, in order to improve the efficiency of mouse oocytes immunofluorescence staining. There are 2 different methods to process mouse embryonic cells. （ 1） Fix cells using 4% paraformaldehyde (PFA) for 30 minutes；（2） Fix cells using 4% PFA which was mixed 0.1% Triton X-100 for 30 minutes. It show
7、s that the second method is better in immunofluorescence staining and can detect more Pyk2 protein localization in mouse embryos and skin contact surface. Keywords: fixation，Pyk2, mouse embryonic cells，immunofluorescence staining1 引言1.1 超数排卵和小鼠早期胚胎发育小鼠作为一种模式生物，其胚胎发育与人类比较接近，已经成为胚胎发育学的研究重点。它可以作为很多人类疾病
8、的动物模型，所以小鼠胚胎发育的研究对一些疾病的研究具有十分重要的意义。利用外源激素促使动物超数排卵(以下简称超排)是进行胚胎移植、转基因动物生产、动物克隆和人类不孕症等研究的重要基础和保障 1。超数排卵的效果受动物品系、营养水平、年龄、发情周期阶段、光照、超排方法、超排所用激素种类和剂量等诸多素影响，其中激素剂量和动物品种是一个关键因素 2。小鼠是医学研究领域应用较广泛的一类实验动物，各品系小鼠进行超数排卵的比较研究对动物的胚胎工程等工作的开展具有重要意义 3。BALB/c 小鼠是国际通用的近交系小鼠，KM 小鼠是中国自行培育的远交系小鼠，ICR 小鼠是国际通用的远交系小鼠，也是目前国内转基因
9、研究的常用品系。Brinster 等报道动物品系对转基因整合效率有一定影响 4。为此，本实验选取了同种 ICR 小鼠品系，采用国产孕马血清促性腺激素(pregnant mare serumgonadotropin，PMSG)和人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，HCG)对小鼠进行了超数排卵处理 5。受精卵经卵裂、桑椹胚形成胚泡后，胚胎细胞迅速增长分化为三胚层、胚胎体形、脸形特征以及主要器官系统的雏形的建立 6。卵裂及胚泡的形成是受精卵在由输卵管向子宫运行中进行的。胚泡滋养层细胞迅速增殖，由单层变为复层，外层细胞融合形成合体滋养层，深部的一层细胞界限明显
10、，称细胞滋养层。植入后，滋养层向外长出许多指状突起，称绒毛，逐渐发育、分化形成胎盘 7。滋养层直接从母体血液中吸取营养供胚胎发育所需。 原肠胚时进行胚泡内细胞团细胞增殖与重排。靠近胚泡腔的细胞形成一层立方形细胞，为胚胎本身的内胚层；内胚层上方的细胞呈柱状，为外胚层；两层细胞紧密相贴形成椭圆形的二胚层胚盘 8。胚盘下方内胚层延伸，形成卵黄囊内层。胚盘内胚层构成卵黄囊顶壁，胚盘上方外胚层与滋养层间出现腔隙，逐渐扩大成羊膜腔。胚盘外胚层构成羊膜囊底壁，羊膜囊其余部分来自滋养层。胚盘上原条的出现与退缩，标志着中胚层的形成与三胚层胚盘的建立。中轴线的中胚层形成脊索。在脊索头端前方及原条尾端后方各有一圆形
11、区，没有中胚层进入，内外胚层紧密相贴，分别称口咽膜及泄殖腔膜，为以后形成口腔和肛门的部位。脊索诱导其上方外胚层增厚形成神经板，进而形成神经沟及神经褶，神经褶在背中线愈合形成神经管 9。神经管头端与尾端尚未闭合的孔，称前、后神经孔。 三胚层所构成椭圆形扁平胚盘，由于其中部细胞生长迅速，周缘向腹侧卷折，分别形成头褶、尾褶及腹褶。头、尾、腹褶进一步卷折向中央收缩，在胚体腹侧与尿囊及卵黄囊柄的附着点形成一圆柱形脐带区。胚胎由盘状逐渐形成头宽尾细的圆柱形，胚体悬浮于羊膜腔内羊水中。 正如引言所说小鼠作为哺乳类动物的模式生物。其胚胎发育与人类比较接近，可以作为很多人类疾病的动物模型，而且小鼠的基因组序列已
12、全部测出，使得研究方向更为明确。由于老鼠的基因更接近人类，所以人类的一些疾病可以模拟在鼠的身上，以寻求治疗疾病的方法。另外，小鼠胚胎分裂速度很快，可以在很多的时间内分裂出很多细胞，所以可以做为有毒物质毒性的指示剂，比如空气污染物之一的苯。因为苯对小鼠胚胎细胞有致畸致癌的作用，所以很容易观察出小鼠是否发生病变。1.2 Pyk2 蛋白富含脯氨酸的酪氨酸激酶（proline-rich tyrosine kinase，Pyk2） 是一种酪氨酸蛋白激酶，通过特异性磷酸化多种蛋白质的酪氨酸残基而使蛋白质活化。研究已发现 Pyk2 在多种细胞中表达，参与细胞迁移、增殖、分化、凋亡等多种细胞生理变化调节 10
13、。在大鼠卵母细胞中已经检测到 Pyk2 的表达和定位，发现与微丝的功能相关。在小鼠卵母细胞中是否表达，如果表达又具有什么功能还从未见报道。 根据以往经验，从 Pyk2 的荧光染色结果可以看出，刚从卵泡中释放出来的 GV 期卵母细胞中就有 Pyk2 的表达，并且在包括细胞核在内的整个细胞中分布。在体外培养的过程中，Pyk2 明显地向核内集中，至生发泡破裂前，Pyk2 的定位与染色体密切相关。从这些结果我们看出，Pyk2 似乎与生发泡破裂前的细胞核的功能有关。我们知道，卵母细胞的成熟包括细胞质成熟和细胞核成熟，与减数分裂完成有关的各种能量信息物质合成并储存在卵胞质中是细胞质成熟所必需的，而染色质凝
14、集成染色体，发生生发泡破裂是细胞核成熟的内容。细胞质和细胞核的成熟对于卵母细胞恢复减数分裂都很重要，二者缺一不可。因此，从 Pyk2 在 GV 期卵母细胞的核中定位来看，Pyk2 可能与染色体的凝集有关。许多家畜类哺乳动物，如猪、牛、羊等卵母细胞体外培养一般经过较长的时间才能恢复减数分裂（如猪卵母细胞需 18-24 小时） ，在这一段时间里，细胞核内有大量的基因转录，用蛋白质合成抑制剂放线菌酮处理卵母细胞可以抑制 GVBD 的发生，但是小鼠卵母细胞体外成熟时间很短， 1-2 小时即可发生 GVBD，并且蛋白质合成抑制剂并不能阻止该过程发生。那么，小鼠卵母细胞核在体外培养的短暂时间内除了蛋白质凝
15、集是否还具有其它功能，比如转录，至今还不清楚。但是在体细胞的研究中发现，Pyk2 存在核转位现象，和细胞核的转录功能相关。在体外培养的皮肤角质细胞中，Pyk2 也被发现定位在细胞核中，它的活化可以提高 Fra-1 和 JunD 两个转录因子的活性，通过调节基因转录参与角质细胞的分化。以往的研究表明，在小鼠卵母细胞的生发泡中检测到许多在减数分裂中具有重要功能的酶，如磷酸化的 PKC，因此我们进一步探究 Pyk2 蛋白在小鼠胚胎发育过程中的定位，及相关功能。1.3 卵母细胞固定和压片技术固定剂有多聚甲醛( paraformal dehyde, PFA )及有机溶剂乙醇 、甲醇 、丙酮 等几种, 其
16、中以PFA 最为常用 15。PFA 的工作原理是: 甲醛与蛋白质的氨基发生反应, 使蛋白质凝固, 降低蛋白质的水溶性, 保持细胞结构完整。常用的渗透剂为表面活性剂Triton X-100, 它可以使脂质细胞膜的通透性增强 , 使大分子抗体易于进入细胞内与抗原特异性结合 11。曾经有人为了探索有效的染色前固定及渗透卵母细胞的方法, 以提高小鼠卵母细胞免疫荧光染色的效率 17。他们在实验中采用了4种不同的固定及渗透方法处理小鼠卵母细胞的方法。 方案A: 先用4%多聚甲醛( PFA)固定1 h, 再用0. 5% Triton X100穿透10 m in;方案B: 先用0. 5% Triton X10
17、0穿透10 m in, 再用4% PFA 固定1 h;方案C: 用 1% PFA + 0. 5% Triton X100同时固定与穿透1 h;方案D: 用- 20预冷甲醇固定15 m in。分析10种核蛋白( TFA、TFB、TAF1、TAF4、pol、BRF1、M eCP2、MBD2ab、HP1及HP1 )在小鼠卵母细胞中的免疫荧光染色效果。他们发现只有方案C 能够完全检测出这 10种蛋白质。于是他们得出的结论是用 1% PFA +0.5% Triton X100同时固定与穿透 1 h, 可以在小鼠卵母细胞形态保持良好的同时检测出更多的蛋白质 12。卵母细胞的固定、染色及制片对于研究卵母细胞
18、的形态、结构很重要, 但一直以来单细胞固定、染色是实验研究中的技术难点 13。因为普通的单个细胞, 特别是卵母细胞在固定过程中容易丢失,而且细胞体积过大, 在制片过程中容易导致细胞破裂。所以单细胞固定、染色及制片的方法显得尤为重要 14。对于体内体积最大的卵母细胞, 它不能用普通细胞免疫组织化学方法完成固定、染色及制片的原因如下: 卵母细胞体积较大, 数量稀少, 受精前停留在第二次减数分裂中期, 不能爬片生长, 因此也就不能像普通体细胞那样制作细胞爬片; 而且细胞悬液滴到玻片上时同样会有卵母细胞的丢失,并且因为卵母细胞体积大, 体表面积与容积比率大,细胞在滴片过程中容易碎裂, 因此很难将卵母细
19、胞固定于玻片上。为了解决这些问题, 目前在实验中采用了液滴培养法, 即卵母细胞固定及染色的操作步骤均在液滴中进行, 在显微镜下通过毛细玻璃管在液滴内移动细胞、洗涤细胞, 避免了卵母细胞的丢失和破碎; 因为卵母细胞不易固定于玻片上,因此卵母细胞的固定过程不能像普通体细胞那样漂洗; 普通体细胞体积小, 脱水之后体积更小, 故压片过程中不存在破裂问题, 但卵母细胞体积较大,压片过程中容易破裂, 目前采用封片胶制作成长方体小柱, 分别置于液滴的正对盖玻片的4个角上, 用于分担盖玻片的压力, 有效地避免了这个问题 15。液滴法和点柱法虽能有效地解决卵母细胞固定、染色及制片中存在的问题, 但在实际操作过程
20、中, 仍需注意以下 2 点: 制片过程中含有卵母细胞的抗荧光淬灭剂液滴大小要适中, 液滴过大不易于扫描观察, 液滴过小压片过程中容易压破卵母细胞, 故液滴大小很重要 16。通过实验证实, 23 l大小的液滴, 在盖玻片盖下时正好不会溢出盖玻片的面积, 并且整个盖玻片都可以被液滴浸润, 有效的避免了卵母细胞的丢失; 用于分担盖玻片压力的小柱大小要适中, 太高会影响盖片后的扫描观察,太低又起不到分散压力的作用, 小柱的大小要在实验中不断调试。如果做好了这2 点, 卵母细胞的固定及压片将不再困难。本研究采用2组不同的固定剂与渗透剂的组合方案, 以402位点磷酸化的pyk2蛋白为研究对象, 通过免疫荧
21、光技术检测其在二细胞小鼠胚胎细胞成熟过程中的精确分布情况, 以期优选出一种快速、简捷、高效的小鼠胚胎细胞固定和渗透方法。2 实验材料2. 1 实验动物ICR 小鼠, 雌鼠 6 8 周龄, 体质量约 20-30g,雄鼠 12 周龄。购自北京维通利华实验动物中心。买回后自由取食饮水，在 12h 光照，12h 黑暗的条件下适应性饲养一周。小鼠的饲养房要保持室外整洁，墙壁、门窗、地面等无尘土，无蜘蛛网，最好是室内每月用 0.1的新洁尔灭喷雾消毒 1 次，室外用 3来苏尔消毒一次。鼠架每周要用消毒药液的湿布擦洗一次。垫料要保持清洁和干燥，放在专用的房间贮存，严格防止猫、野鼠、狗等窜入。2. 2 实验器材
22、注射器、一次性手套、大、小镊子剪刀各一套、酒精棉球、一次性平皿（大、小）、玻璃针、载玻片、盖玻片、记号笔、四孔皿、 湿盒、暗盒、（1ml、200l、20l、10l、2.5l）移液器、遮光片、大小EP管、尖头镊子、解剖盘、解剖刀2. 3 实验药品PMSG、HCG：购自浙江宁波三生药业有限公司G1培养液：购自Vitrolife公司一抗：（Abcam牌子的 Anti PYK2（phospho Y402） antibody ab131543.兔源的-402位点磷酸化的PYK2蛋白的抗体）二抗：（FITC标记的羊抗兔lgG（H+L).ZF-0311）碘化丙啶（PI） 、抗荧光猝灭剂、甘油、NaCl、KC
23、l、Na 2HP、KH 2PO4、 PFA。以上实验药品如无特殊提均购自美国 Sigma 公司。2. 4 试剂配制（1）常规固定液：称取0.2g多聚甲醛（PFA）加入4.5ml三蒸水中加热到50度然后加入7l NaOH助溶，冷却到室温再加PBS0.5ml （固定液现配现用，一周更换一次）（2）改进固定液配制：取100l常规固定液加入1l 10的 Triton X-100（3）孵育液：配制时称取0.61g MgCl6H20、0.292g NaCl、0,477g Hepes、10.209g 蔗糖、0.02g NaN3、50l 10 Triton X100，依次加入50ml的水中，调pH到7.4，定
24、容到100ml（4）清洗液：取 1ml 10的PBS加入9ml三蒸水，然后加入1ul 10 Triton X-100、1ul tween 20（5）10PBS缓冲液：称取NaCl 8.01g，KCl 0.201g，Na 2HPO4 1.54g，KH 2PO4 0.19g 充分溶解后三蒸水定容到100 ml，调PH值到7.2-7.4之间，4保存；用时1:10倍稀释（6）封闭液：0.01gBSA、1ml清洗液，待充分溶解后，4保存；1%BSA用5%BSA溶液与1PBS配制，即40mL5%BSA与160m1PBS混合而成（7）PI染液：称取PI0.01g加入10mlPBS中配成浓储液，用时取1ul
25、浓储液加入1mlPBS中配成10ul/ml的工作液，分装后-20度保存抗荧光淬灭剂：三聚乙烯丙二胺0.4g，0.2ml/L Tris-HCl(pH7.4) 2ml,甘油18ml混合溶解。4度避光保存。2.5 实验仪器体视显微镜 （Motic， 厦门），CO2 培养箱 （SUNYO，日本）超净工作台 （哈东联，北京）电子天平 （赛多利斯，北京），电热鼓风干燥箱 （森信，上海），自动三重纯水蒸馏器 （亚荣，上海）3 实验方法 3.1 超数排卵和小鼠早期胚胎的收集二细胞小鼠胚胎细胞的收集: 取ICR小鼠，在小鼠腹腔注射孕马血清促性腺激素（PMSG） ，促进卵泡发育。48 h后, 腹腔注射人绒毛膜促性
26、腺激素(HCG) 10 IU,进行超数排卵。注射注射HCG 后立即与健康康良好身体状况的雄鼠合笼。合笼后40h，64h，68h不同时间,颈椎脱臼法处死小鼠, 分离输卵管, 将分离的输卵管尽可能全部划开，用拉细的玻璃针收集2细胞，4细胞，8细胞的小鼠胚胎，并在G1培养液中清洗待用。取材的注意事项：取材动作要迅速，不宜作太久的拖延以免组织细胞的结构、成分等发生变化。3.2 免疫荧光染色用荧光抗体间接标记法检测 Pyk2 在小鼠卵母细胞受精卵和早期胚胎发育过程中的定位情况，通过共聚焦扫描显微镜观察其分布变化。对照组：将不同时期的受精卵(或早期胚胎)于 4%多聚甲醛中固定 30 分钟(囊胚固定 40 分钟)，再在孵育液(300mM
