1、1毕 业 论 文论文题目：金莲花化学成分的初步研究年级班级： 中药学（日语强化）班2目 录中文摘要2英文摘要3第1章 金莲花的研究概况 41.1 前言 41.2 金莲花化学成分的研究进展 41.3 药理活性及其它应用 7第2章 金莲花的化学成分研究 92.1 从金莲花中分离得到的化合物的编号，名称，结构和鉴定方法 92.2 化学成分的结构鉴定 9第三章 实验部分 113.1 实验材料与仪器 113.2 药材的提取与分离 11第四章 结果与讨论13参考文献 14致谢 163摘 要金莲花(Trollius chinensis Bunge)为毛茛科(Rannuculaceae)金莲花属多年生草本植物
2、，分布于山西、河南北部、河北、陕西、内蒙古东部、辽宁和吉林西部。它在民间应用广泛，具有极大的药用开发价值。本文综合利用正相硅胶柱色谱、反向硅胶柱色谱、Sephadex LH-20 柱色谱、高效液相色谱、重结晶等分离技术，从金莲花提取纯化后的粉末中分离了 3 个化合物，根据理化性质以及 NMR 技术进行结构鉴定，分别为：3-甲氧基-4-羟基苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、荭草苷。关键词：金莲花；分离技术；结构鉴定 4AbstractTrollius chinensis Bunge(Ranunculaceae) is a perennial herb,widely distributed in Shan
3、xi,north of Henan,Hebei, Shanxi, east of Inner Mongolia,and west of Liaoning and Jilin provinces. Its flowers are widely used and have great medicinal development value. The normal phase silica gel column chromatography, reversed phase silica gel column chromatography, sephadex LH-20, HPLC, recrysta
4、llization had been used for the separation and purification and three compounds had been separated from Trollius chinensis Bunge flowers of extract separation.According to the physical and chemical properties and NMR technology to the structure identification, respectively is:methyl p-hydroxybenzoat
5、e、OrientinKeywords: Trollius chinensis Bunge; isolation technique; structure identification5第一章 金莲花的研究概况1.1 前言金莲花别名旱金莲、旱地莲、金芙蓉、金梅草等，是毛茛科金莲花（Trollius chinensis Bunge）的干燥花，多年生宿根草本植物，其花可供药用，味苦，性寒，无毒。药材呈不规则团状，皱缩，颜色为金黄色或棕黄。金莲花生长在海拔 1000-2200 米的山地草坡或疏林下。金莲花属植物中，在中国常见的品种有，金莲花（T.chinensis Bge.），短瓣金莲花（T.lede
6、bouri Reichb.），长瓣金莲花（T.macropetalus Fr.Schmidt.），阿尔泰金莲花（T.altaicus C.A.Meg.），亚洲（宽瓣）金莲花（T.asiaticus L.）等十几种，其多为野生状态，在我国分布较为广泛。金莲花在中国民间药用历史悠久，是清代始建应用的一种草药，在中、蒙药中有很高的医用价值。据记载中药金莲花功能为清热解毒、治上感、扁桃体炎、咽炎等；蒙药多配方用，治疗创伤、目赤、痈肿。其化学成分主要含有黄酮类、有机酸类、香豆素类、生物碱类，药理活性显示它对革兰氏阳性菌和多种病毒有明显的抑制作用。基于金莲花目前的化学成分和药理活性，为以后金莲花药用价值的
7、开发提供理论依据，作者对金莲花的化学成分进行了初步的研究。1.2 金莲花化学成分的研究进展根据现有的文献报道，已经从金莲花中提取分离的化学成分主要有黄酮类、有机酸类、生物碱类、挥发油类。除上述成分外，还有香豆素、树脂、多糖、鞣质及多种甾醇类化合物，但相关报道很少。1.2.1 黄酮类成分研究表明，黄酮类是金莲花主要的化学成分及其有效活性成分。目前已从金莲花中提取分离出近 20 种黄酮类化合物，以 1 荭草苷（Orientin）、2 牡荆苷（Vitexin）为主。金莲花属中黄酮类成分多数以黄酮苷的形式存在，而少数以游离的形式存在。其化学结构特征是：基本骨架为黄酮、黄酮醇。1992 年，刘丽娟等首次
8、从长瓣金莲花中得到两种黄酮类化合物：3 牡荆素-2-O-D-吡喃6木糖苷（vitexin-2 -O-D-pyranxyloside）和 4 荭草素-2-O-D-吡喃木糖苷（orientin-2-O-D-pyranxyloside）。2000 年，黄文哲等又从短瓣金莲花中分离到一种氧苷黄酮槲皮素-3-O- 新橙皮糖苷。2004 年，宋冬梅等还从阿尔泰金莲花中分离到一种甲氧基黄酮柯伊利素，这是首次从金莲花属植物中分离到该物质。71.2.2 有机酸类成分目前研究发现金莲花的有机酸成分主要有 1 金莲酸（globeflowery acid）、2 藜芦酸（veratric acid）、软脂酸（palmi
9、tic acid）等。 2008 年，李胜银等分离出 4-(-D-glucopyranosyloxy)-3-(3-methyl-2-butenyl)benzoic acid。2010 年，刘召阳等从金莲花中又分离得到一种有机酸类化合物乌苏酸。2012 年， 魏金霞等从金莲花中分离出原儿茶酸。1 21.2.3 生物碱类成分通过查阅大量国内外文献得知，目前从金莲花中提取分离得到的生物碱类成分有三种，外国文献报道中分离得到两种吡咯双烷类生物碱（Pyrrolizidine alkaloids），千里光宁（ Senecionine）和全缘碱（ Integerrimine）。2012 年，国内学者魏金霞等
10、从金莲花中分离出一种新的生物碱金莲花碱（Trolline）。金莲花碱：无色片状结晶(甲醇)，mp 165.0167.0。三氯化铁-铁氰化钾反应阳性，提示结构中存在酚羟基；体积分数为 10% 硫酸乙醇溶液显淡黄色斑点，紫外 365 nm 波长下显黄色荧光。81.2.4 挥发油类成分1998 年，冯学峰报道金莲花中的挥发油以挥发性脂肪酸为主，相对含量较高的有十四烷酸（tetradecanoic acid，21.34% ）、十二烷酸（dodecanoic acid，20.57% ）、十六烷酸（hexadecuneic acid， 5.46%）、9,12,15-十八碳三烯酸（9,12,15-octad
11、ecatnenoic acid，4.47%）、正二十一烷（n- heneicosane， 2.30%）、十四酸甲酯（methyl tetradecanoate，1.51%）、十六酸甲酯（methyl hexadecanoate，1.50%）、癸酸（decanoic acid，1.31%）、芳樟醇（1inaloo，1.32%）。1.3 药理活性及其它应用近年来，许多学者对金莲花属植物抗菌、抗病毒、抗氧化活性成分的研究日益增多，主要包括黄酮类和有机酸类化合物。在临床上表现为它对上呼吸道感染、扁桃体炎、咽炎和急性中耳炎等症有效，对急性阑尾炎、细菌性痢疾、泌尿系统感染、急慢性支气管炎等也有较好的治疗效
12、果。目前，已有学者对其它中药材的发酵成分及其应用价值进行了一系列的研究并取得相应的成果，但对金莲花发酵物的研究领域仍然处于一片空白。1.3.1 抗菌活性1973 年,北京制药厂的体外抑菌实验结果表明,金莲花抑菌谱较广,在体外对革兰氏阳性球菌和革兰氏阴性杆菌均有较好的作用,如绿脓杆菌、甲链球菌、肺炎双球菌、卡他球菌、痢疾杆菌等菌。尤其是对绿脓杆菌的作用比较明显。2001 年，杨宜婷等用枯草芽孢杆菌 ATCC6633、表皮葡萄球菌 ATCC12228、金黄色葡萄球菌 ATCC6538P、藤黄微球菌 ATCC9314 作为受试菌种发现金莲花试样的抑菌效果为：总黄酮牡荆苷+ 荭草苷原金莲酸，从而得出金
13、莲花属植物的抑菌活性是多种化学成分协同作用的效果。1.3.2 抗病毒活性金莲花水提液对 CoxB3 病毒有很强的抑制作用，对 CoxA24 变异株有一定抑制作用。苏连杰等用金莲花乙醇提取物对感染流感病毒的小鼠进行研究，结果显示中、高剂量组感染病毒小鼠的存活时间明显延长。1.3.3 抗氧化活性2006 年，周欣等指出：短瓣金莲花中牡荆苷、荭草苷、槲皮素-3-O-新橙皮9糖苷、槲皮素-3-O-巢菜糖苷等四种黄酮苷单体具有较强的体外抗氧化活性。例如，它们对 DPPH 自由基有很强的清除作用，能明显的清除OH 和抑制大鼠红细胞氧化性溶血的作用。1.3.4 临床应用早在 1973 年北京制药厂就将金莲花
14、片剂及针剂应用于临床，治疗扁桃体炎、呼吸道感染等。随着人们不断对金莲花的研究，有学者发现其抗菌谱广、疗效显著且无明显毒副作用，临床用于治疗泌尿系统感染疗效极好。根据现有资料显示，临床采用金莲花软胶囊治疗咽炎，无论是治愈率还是症状改善方面都比阿莫西林软胶囊疗效好，临床推广性很高，发展前景广阔。1.3.5 保健价值金莲花嫩梢、花蕾及新鲜种子可作辛辣调味品。金莲花茶是承德百姓家里的常备的，为优质的民间茶，其保健价值得到了大家的认可。花朵根据其风味特点和个人习惯，可拌、可炒、可炖、可泡，也可做馅制做各种风味独特的点心。欧美人则更喜欢用来调制沙拉、制作三明治以及做汤等。1.3.6 卷烟加香随着社会的进步
15、和科学技术的发展，人们对生活质量愈发关注，因此金莲花应用到卷烟加香工艺中的前景广阔。金莲花浸膏中的挥发性成分具有清甜的花香，对提高卷烟的抽吸品质具有重要作用。其中，高级脂肪酸能改变卷烟烟气的粗劣感而使其具有清甜柔和的味道，酯类物质特有的香气则可以提高和改善卷烟的气味，使之更香醇，味道更佳。金莲花浸膏中的微量香味物质同样不容小觑，如苯乙醛的玉簪花香气浓郁，苯乙醛的玫瑰香气清甜， 环柠檬醛具有独特的甜味。综上所述，金莲花浸膏可以应用于卷烟加工工艺中，以增加卷烟的香气，减轻呛鼻的刺激感，掩盖烟草的杂昧，使卷烟具有独特的风味口。10第二章 金莲花的化学成分研究本实验采用正相硅胶柱色谱法、反相硅胶柱色谱
16、法、Sephadex LH-20 柱色谱、高效液相色谱、重结晶等分离技术，从金莲花提取纯化后的粉末中分离了3 个化合物，根据理化性质以及 NMR 技术进行结构鉴定，分别为 3-甲氧基-4-羟基苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、荭草苷。2.1 从金莲花中分离得到的化合物的编号，名称，结构和鉴定方法No. Name Structure MethodsComp 13-甲氧基-4-羟基苯乙醇H3CO OHHO1H-NMRComp 2 对羟基苯甲酸甲酯 HOOCH3 1H-NMRComp 3 荭草苷 OOOHOHHOCH2OHOOH 1H-NMR2.2 化学成分的结构鉴定化合物 1：黄色油状物（甲醇），Mp。紫
17、外 254nm 下显暗斑，10%硫酸-乙醇显粉红色，三氯化铁-铁氰化钾反应阳性，提示结构中存在酚羟基。 1H-NMR（400MHz，DMSO-d 6）谱中： 8.79（1H，s ）为酚羟基质子信号， 6.78（1H，d，J = 8.12Hz），6.63（1H，d，J = 2.0Hz），6.56（1H ，dd，J = 118.12，2.0Hz）为苯环 ABX 偶合系统质子信号；同时存在一组-CH 2-CH2-质子信号 3.52（2H，t，J = 7.2Hz）和 2.57（2H，t，J = 7.2Hz）； 3.71（3H，s）为甲氧基信号。将上述波谱数据与文献对照基本一致，鉴定该化合物为 3-甲氧
18、基-4-羟基苯乙醇 （3-methoxy-4-hydroxymandelic），结构式如下：H3CO OHHO化合物 2：无色针状结晶（甲醇）。三氯化铁-铁氰化钾反应阳性，溴甲酚绿反应阴性，提示结构中存在酚羟基而无羧基。 1H-NMR（400MHz，DMSO-d 6）谱中：10.34（1H，s）为活泼羟基信号，一组对位取代苯环上 AABB偶合系统质子 6.85（2H，d，J = 8.8Hz），7.82（2H，d ，J = 8.8Hz），同时给出 3.78（3H，s）为甲氧基信号。将上述波谱数据与文献对照基本一致，鉴定该化合物为对羟基苯甲酸甲酯（methyl p-hydroxybenzoate
19、）结构式如下：HOOCH3化合物3：黄色粉末（甲醇）。盐酸-镁粉反应阳性，三氯化铝反应阳性，Molisch反应阳性，提示该化合物为黄酮苷类化合物。 1H-NMR（400MHz，DMSO-d 6）谱中： 13.18（1H，brs）为5位缔合酚羟基质子信号； 7.53（1H，brd， J = 8.3 Hz），7.48（1H ，brs ），6.86（1H，d，J = 8.3 Hz）为黄酮 B环ABX偶合系统质子信号； 6.64（1H，s ）为3位质子信号； 6.26（1H，s）为6位质子信号； 4.68（1H，d，J = 9.8 Hz ）为糖端基质子信号，根据其偶合常数判断其为碳苷类化合物，且其苷键
20、为构型； 3.233.86（6H ，m）为糖上其它的氢信号。上述理化性质、波谱数据与文献对照基本一致，故鉴定该化合物为荭草苷（orientin），结构式如下：OOOHOHHOCH2OHOOH12第三章 实验部分3.1 实验材料与仪器3.1.1 实验材料金莲花由陕西慧科植物开发有限公司提供。HPD-100 型大孔树脂（沧州宝恩吸附材料科技有限公司）；薄层色谱硅胶 GF254、柱色谱硅胶（青岛海洋化工厂）；SephadexLH-20（ Amersham Pharmacia Biotech AB 公司）；色谱甲醇（天津康科德科技有限公司）；其他试剂（分析纯，市售）3.1.2 实验仪器RE-52AA
21、型旋转蒸发仪（上海亚荣盛华仪器厂），SHB- 型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司），DLSB-5/20 型低温冷却液循环泵，HS3120D 型超声波清洗器( 昆山市超声仪器有限公司) ，电子恒温水浴锅（天津力泰斯仪器有限公司）；UV-8 紫外灯（北京亚兴泰机电设备有限公司）；干燥箱（南京沃环科技实业有限公司）；YP202N 电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；TH- 2000 型数控超声波清洗器（济宁天华超声电子仪器有限公司 ）；ARX-400、AV-600 核磁共振仪（瑞士 Bruker 公司）。3.2药材的提取与分离3.2.1 金莲花药材提取与药用成分富集取金莲花的干燥花 7.
22、5 kg，用 16 倍量 60%乙醇回流提取 3 次，每次 1.5 小时，合并提取液浓缩至 75 L，抽滤，备用。大孔树脂初步分离 （1）大孔树脂预处理：商品树脂均残留惰性溶剂，故使用前根据应用需要，必须进行不同深度的预处理。将适量的 D101 型大孔树脂置于桶状容器中，使用 95%乙醇浸泡，直至浸泡液澄清，且经过旋转蒸发仪回收溶剂后，烧瓶底无白色残留物为止。将乙醇清洗后的树脂用蒸馏水反复浸泡，除去漂浮于水面的树脂残屑。经过 95%乙醇、蒸馏水洗涤，以低浓度乙醇溶液树脂装柱即可。（2）大孔树脂富集黄酮类化合物：将金莲花提取液用 D101 大孔吸附树脂柱色谱分离纯化，先用水洗脱，后用 50%乙醇
23、溶液洗脱，最后得到 50%乙醇洗脱物 630 g。13提取流程图如下所示：金 莲 花 药 材 （ 7.5Kg）醇 提 物 （ 75L）60%乙 醇 提 取D10大 孔 吸 附 树 脂H2O 50%EtOH水 洗 脱 液 醇 洗 脱 液干 燥粉 末 （ 630g）3.2.2 硅胶柱色谱初步分离：取 50%乙醇洗脱物 110 g 进行硅胶柱色谱（200 - 300 目）分离，以不同比例的二氯甲烷- 甲醇（100:0 - 0:100）进行梯度洗脱，每个流份收集 300 ml，共收集 513 个流份，薄层鉴别合并后共得到 13 个流份（Fr.1 - 13）。3.2.3 化合物分离纯化1:1-0:100
24、 Fr.1- Fr.3Fr.4约1.76g，用3.0g柱层析硅胶拌样，以二氯甲烷 -甲醇（100:0 - 0:100 ）进行梯度洗脱，将样品根据TLC显色状况及紫外下状况合并为5 组流分。5 组流分分别采用重结晶法及高效液相，得到化合物1及化合物2。Fr.11约11.2g，用18g柱层析硅胶拌样，以二氯甲烷-甲醇（100:0 - 0:100）进行梯度洗脱，将样品根据TLC 显色状况及紫外下状况合并为10 组流分，Fr.11.6 采用Sephadex-LH20柱色谱和高效液相，得到化合物3。50%乙 醇 大 孔 树 脂 洗 脱 物 （ 10g）硅 胶 柱 色 谱二 氯 -甲 醇 系 统10:-1
25、0:1 90:1-60:150:1-3:1 2:1 1:-0:10Fr.1-Fr.3 Fr.4Fr.5-Fr.10Fr.1Fr.12-Fr.13化 合 物 1化 合 物 2 化 合 物 3重 结 晶 法 及 高 效 液 相 Sephadex-LH20柱 色 谱高 效 液 相14第四章 结果与讨论采用反复硅胶柱色谱法、SephadexLH-20 柱色谱法、重结晶等方法进行分离纯化，金莲花提取纯化后的粉末中分离了 3 个化合物，根据理化性质以及NMR 技术进行结构鉴定，分别为 3-甲氧基-4-羟基苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、荭草苷。15参考文献1 钱庄, 周哲, 石雪静, 等. 金莲花化学成分及其提
26、取分离的研究进展J. 中国药物经济学, 2014,(02):95-98.2 王书华, 饶娜, 安芳. 金莲花多糖的分离纯化及其抗氧化作用研究J. 中成药, 2013,(11):2384-2389.3 李世相, 赵凤舞. 金莲花化学成分提取及抗菌作用研究J. 中兽医医药杂志, 2013,32(5):8-12.4 周哲, 钱庄, 石雪静, 等. 金莲花活性成分研究及其应用J. 亚太传统医药, 2014,10(12):42-44.5 宋成英, 黄俊懿. 金莲花有效成分的提取分离与药动学探微J. 时珍国医国药, 2013,24(7):1715-1716.6 魏金霞, 李丹毅, 华会明, 等. 金莲花化
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28、分研究J. 亚太传统医药, 2008,(07):18-19.12李占林, 李丹毅, 吴瑛, 等. 金莲花抗菌有效成分J. 沈阳药科大学学报, 2008,(08):627-629.13吴新安, 赵毅民, 赵刚. 短瓣金莲花黄酮碳苷类化学成分研究J. 中国中药杂志, 2007,(09):864-865.14周欣, 范国荣, 吴玉田. 短瓣金莲花总黄酮及指标性成分的体外抗氧化活性研究J. 中药材, 2007,(08):1000-1002.15叶云峰, 彭勇, 付岗, 等. 药用金莲花研究新进展J. 中国现代中药, 2007,(03):1629-33.16黄建茹, 索全伶, 朱明达, 等. 金莲花属药
29、用植物的研究与应用J. 内蒙古石油化工, 2006,(07):4-5.17朱殿龙, 丁万隆, 陈士林. 金莲花属植物的研究进展 J. 世界科学技术, 2006,(04):26-33.18任正博, 张振学, 周伟利, 等. 金莲花化学成分研究J. 中国现代中药, 2006,(02):14-15.19范新田, 傅强, 李凤丽, 等. 金莲花研究现状与展望J. 北华大学学报(自然科学版), 2006,(02):131-134.20罗丽荣, 蒋柏泉, 白兰莉. 金莲花有效药用成分提取研究 J. 江西化工, 2006,(03):96-98.21苏连杰, 王辉, 苏志伟, 等. 金莲花属植物的化学成分与药
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31、J. 河北林果研究, 2004,(04):392-396.27林秋凤, 王凌云, 李药兰, 等. AB-8 大孔吸附树脂分离长瓣金莲花总黄酮J. 暨南大学学报(自然科学与医学版), 2003,(01):55-58.28辛春兰, 潘海峰. 金莲花的研究进展J. 承德医学院学报, 2003,(04):348-350.29杨宜婷, 李药兰, 岑颖洲, 等. 金莲花的研究进展J. 中药材, 2000,(09):585-587.30黄文哲, 王磊, 段金廒. 短瓣金莲花化学成分的研究J. 中草药, 2000,(10):13-14.17致 谢五年的大学生活在这个生机勃勃的季节即将划上一个圆满的句号，而我的
32、人生在这个时节却只是一个逗号，新生活的征程已经在向我挥手。五年的求学生涯在各位师长、同学、亲友的支持和帮助下走得艰辛却收获颇多，没有你们，我的大学生活不会那么绚丽多彩而又充满意义。首先，我要把我的敬意和赞美献给我的导师教授，他严谨的科学态度和渊博的学术知识为我营造了一种良好的精神氛围。置身其中、耳濡目染、潜移默化使我接受了全新的思想观念，领会了基本的思考方式，从论文题目的选定到论文写作的指导经由老师的点拨，常常让我有一种恍然大悟的感觉。在此，向张老师表达最崇高的敬意和最真诚的感谢！第二位要感谢的人便是在我专题实验期间给予我无言的帮助和关怀的石亚杰师姐，虽然处于研二时期的她又忙又累，是实验室里来的最早、走的最晚的一个，但是在我专题期间她却让我学习到了很多本科时期没有学到的实验知识和技巧，使我受益匪浅。师姐在实验中严谨的态度和坚持不懈的精神成为了我今后努力进修的动力和方向塔。再一次向师姐表示感谢！最后感谢实验室其他的师兄师姐和小伙伴们，感谢你们一路以来的支持和陪伴，你们每一个人都将成为我人生最宝贵的财富！18化合物 1化合物 219化合物 320
