1、实验一 果蝇的性状观察与饲养一、实验目的了解果蝇的生活习性，掌握果蝇饲养管理的方法，鉴定果蝇的雌雄性别和突变性状。二、实验原理普通果蝇（Drosophila melanogaster）为双翅目昆虫，具完全变态。用果蝇做实验材料有许多优点：生长迅速，每 12 天左右即可完成一个世代；繁殖能力强，每只受精的雌蝇可以产卵 500 个左右，因此在短时间内即可获得大量的子代，便于遗传分析；饲养容易，以玉米粉等做饲料就可以生长繁殖；加之突变性状多达 400 以上，且多数是形态变异，容易观察。三、实验材料野生型果蝇及几种常见的突变型果蝇。四、实验器具和药品试剂生化培养箱、双筒解剖镜、镊子、电磁炉、高压灭菌器
2、、电热恒温干燥箱、培养瓶、棉花塞、烧杯、玻棒、棉签、滤纸。乙醚、酒精、丙酸、酵母粉、琼脂、玉米粉、白糖。五、实验内容和步骤（一）生活史的观察 果蝇的生活史包括卵、幼虫、蛹、成虫四个连续的发育阶段（图3-1） 。卵：卵白色，长椭圆形，长约 0.5mm，在背面的前端伸出一对触丝，它能使卵附着在柔软的食物上，不至于深陷到食物中去。幼虫：幼虫从卵中孵化出来后，经过两次蜕皮到第三龄期，体长可达 45mm 。在解剖镜下观察可见一端稍尖为头部，并且有一黑点即口器；稍后有一对半透明的唾腺，每条唾腺前有一条唾腺管向前延伸，然后会合成一条导管通向消化道。神经节位于消化道前端的上方。蛹：幼虫生活七天左右即化蛹，化蛹
3、前从培养基中爬出附在瓶壁上，渐次形成一个棱形的蛹。起初颜色淡黄、柔软，以后逐渐硬化，变为深褐色，这就显示即将羽化了。成虫：刚羽化出的果蝇，身体狭长，翅还没有展开，身体较白嫩，此时野生型体色与黑檀体体色都是一样的，没有多大区别。不久，蝇体变为粗短椭圆形，双翅展开，体色加深，如野生型果蝇的体色成为灰褐色，突变型黑檀体果蝇的体色成为乌黑色。果蝇生活周期的长短与温度关系密切，30以上时果蝇则将不育且濒临死亡，低温则使它的生活周期延长，同时生活力也降低。培养果蝇的 最适温度是 2025。10 15 20 25卵幼虫幼虫成虫57 天18 天8 天6.3 天5 天4.2 天从表中可以看出，25时，从卵到成虫
4、约 10 天，20 时约为 15 天。盛夏时，果蝇应该放在生化培养箱内饲养或放在有空调的房间内饲养。果蝇生活史1卵 2一龄幼虫 3二龄幼虫 4三龄幼虫 5蛹6成虫(雄) 7成虫( 雌)（二）果蝇雌雄性别的鉴别 果蝇有雌雄之分，幼虫期较难区别，成虫期则较易区别雌雄果蝇的比较：1体型 雌果蝇体型较大，雄果蝇较小；2腹部末端 雌性腹部椭圆，末端稍尖，雄性末端钝圆；3腹部背面 雌性有明显 5 条黑色条纹，雄性有三条，前两条细，后一条宽，延至腹面，肉眼看其腹部末端呈现一明显黑点。4腹部腹面 雌性有较明显的 6 个腹片，雄性有 4 个腹片。5性梳 雄性第一对足的跗节基部外侧有黑色鬃毛状性梳（见图） ，雌性
5、则无。性梳的有无，是鉴别雌雄性果蝇的明显标志之一果蝇外形左：雄性果蝇的左前足 中：跗节基部的性梳 右：雌果蝇无性梳 C、基节 TR、转节 F 、腿节 TI、胫节 TA 、跗节（三）几种常见的突变性状 实验中常用的果蝇突变性状多可用肉眼鉴别，有一些则可借助于解剖镜辨认，这些性状一般都是明显而稳定的。突变名称 基因符号 性 状 特 征 在染色体上座位 白眼残翅黑檀体焦毛小翅wvgeSnm复眼白色翅全退化，部分残留不能飞身体呈乌木色，黑亮刚毛卷曲如烧焦状翅短仅长至腹端X 1.5 R 67.0 R 70.7X 21.0X 36.1（四）果蝇麻醉 检查果蝇或进行果蝇杂交时，应先进行麻醉，使其保持安静状态
6、。果蝇具有以下一些特性：一是具有趋光性，二是喜欢向上爬。掌握了这些特性，我们就能很方便地将果蝇转移到另外一个培养瓶中。麻醉时，先在棉签上滴上数滴乙醚，将培养瓶口朝下，果蝇即向上爬行。轻抽出棉塞，插进棉签，将棉塞塞住，平放在桌面上（不能将培养瓶竖立，以免果蝇落入培养基中不便取出）约半分钟，果蝇即被麻醉。注意不能麻醉过度，如果果蝇的翅膀与身体呈 45o 角翘起，表明麻醉过度，不能复苏而死亡。麻醉后的果蝇放在滤纸上方便观察。检查后的果蝇可以放回原培养瓶中，也可以进行处死。（五）果蝇培养基 果蝇在水果摊或果园里常可见到，但它并不是以水果为食，而是采食生长在水果上的酵母菌，因此实验室内凡能发酵的基质，均
7、可作为果蝇的饲料。实验室常用的培养基配制方法是：A：糖 62 克，加琼脂 062 克，再加水 38 毫九煮沸溶解。B：玉米粉 825 克，加水 38 毫升加热搅拌均匀，再加 07 克酵母粉。A 和 B 混合加热成糊状后，加 05 毫升丙酸，即可分装到培养瓶中。培养果蝇的饲料瓶，常用的有牛奶瓶、三角瓶、大中型指管，用纱布包裹的棉花球作瓶塞。瓶子和棉塞要高压灭菌消毒。每一瓶大约装 2cm 厚度的培养基。待冷却后，檫干瓶壁上的水珠即可使用。（六）原种培养 在作新的留种培养时，应仔细检查果蝇有没有混杂，有没有突变个体的产生。一般一瓶放两对亲本为宜。果蝇移入新瓶时，需将瓶子横放，待果蝇清醒过来后再把培养
8、瓶竖起。原种每 24 周换一次培养基，最好每一个品种分成两套分别培养。标签上标明品种名称和日期，温度控制在 18左右。原种果蝇培养常遇到的麻烦是培养基发霉。导致发霉的原因很多，用具没有消毒，空气污染，在接种时，果蝇掉在桌面上粘有污染源，又将果蝇捡到瓶中。发现培养基有少量的霉点时，可用烧过的解剖针挑出，或用 70%的酒精棉球将霉点消毒，然后挑出霉点。若大量霉菌污染时，则考虑换新的培养基对原种进行继续饲养了。（七）实验交配 果蝇雌体生殖器官有受精囊，可保留交配所得的大量精子，能使日后产下的卵受精。因此在做杂交时，雌体必须选用处女蝇。雌蝇羽化出来 10 小时内一般不会交配。我们选择在这个时间段内所收
9、集的雌体，均属处女蝇，可放心做为杂交亲本用。雄体可事先收集好，放在一个新的培养瓶中，也可等收集到处女蝇后再收集雄蝇。当两亲本在新的培养瓶中生活 78 天后，可见培养基面上有许多幼虫在爬动，这是子代的幼虫，这时可将两亲本倒出，以免和子代混淆。当子一代果蝇羽化出来后，要观察性状和计数。同时，根据要求可进行 F1 代自交或测交项目。六、作业（一）观察几种突变型的外部特征，比较其与野生型的差别；（二）用肉眼鉴别果蝇雌雄时，应抓住哪一个显著的标志？（三）制备玉米粉琼脂培养基，并进行麻醉与接种练习。实验二 果蝇杂交实验一 实验目的验证遗传规律，掌握数据处理的方法二 实验原理本实验把单因子分离规律、双因子自
10、由组合规律、伴性遗传、两点基因定位及三点基因定位 5 个验证性实验整合为 1 个果蝇经典遗传设计性实验。这点和实验指导书中的所列实验有所不同。要求同学们能用 1 个杂交组合的实验结果验证 45 个遗传规律，从果蝇亲代扩繁、培养基配制、交配设计、转管培养、子一、二代观察与鉴定、实验结果统计分析全实验过程，均由学生独立完成。进行学生实验能力考核；实验室全天性开放，每天7.0020.00 允许学生自由进入实验室，利用课余时间自觉主动地完成各项实验操作；教师督促指导，确保学生在 60 d 内获得全部实验结果。三 实验材料 实验所用的果蝇为两个突变型的果蝇1 号 白眼 小翅 焦刚毛 灰体 6 号 红眼
11、长翅 直刚毛 黑檀体 四、实验器具和药品试剂生化培养箱、双筒解剖镜、镊子、高压灭菌器、电热恒温干燥箱、培养瓶、棉花塞、烧杯、玻棒、棉签、滤纸。乙醚、酒精、丙酸、酵母粉、琼脂、玉米粉、白糖。五 实验内容和步骤：纯合体突变果蝇的培养：根据实验分工，每个实验组培养突变果蝇品种；等到长出幼虫时除去亲本1 挑选处女蝇 先除去培养瓶中的成蝇，然后在 8 小时之内挑选新羽化的成蝇， 此时的雌蝇没有交配，称为处女蝇。将其麻醉挑出，准备杂交。2 杂交 将 e 号处女蝇和 6 号雄蝇 4-6 对（正交）或 6 号处女蝇和 e 号雄蝇（反交）4-6 对放入装有新鲜培养基的瓶子里，在瓶上贴上标签，标明杂交亲本的品系
12、性别 和杂交日期。每组根据要求做正交或反交的一组杂交组合：正交：檀黑身灰身小翅焦刚毛白眼 反交：灰身小翅焦刚毛白眼檀黑身3 除亲本 7-8 天后除去亲本果蝇4 观察 F1 代 。再过 3-5 天，观察 F1 代的眼色 翅型 刚毛 和体色及在不同性别中的分布，注意正反交在 F1 代的异同5 将 F1 代的 1-6 对移入新的培养瓶中。这里无须挑选处女蝇（为什么）6 除去 F1 代成蝇 7-8 天后除去 F1 代成蝇7 F2 代的观察和统计 注意观察 F2 代成蝇第一个出现的日期，在这天开始后的 10 天内可分批观察 分类统计各类型的数量，并列表记录观察结果8 分析实验结果并用卡方测验验证实验结果
13、是否符合有关遗传规律1） 以体色在 F2 代的分布验证常染色体的独立分配规律 2） 以眼色（或除体色以外的）其他性状在 F2 的分布验证伴性遗传3） 用体色和其他一对性状在 F2 代的分布，验证自由组合规律。注意正反交的结果不一样 一组符合 9：3：3；1 的比例， ；另一组符合 6：2：6：2 的比例4） 以眼色 翅型 刚毛在 F1 代的分布决定这三个基因在哪个染色体上 用 F2 代的分布计算重组值和图距对上述各条进行理论推导 计预期的算理论值 用卡方测验来检验实验结果实验结果记录表格F1 代观察记录成交后代数目 反交后代数目表 型 合计 合计灰 长 红 直灰 小 白 焦总 计F2 代观观察
14、记录实验三 果蝇唾腺染色体标本的制备和观察一、目的1. 练习分离果蝇幼虫唾腺的技术，学习唾腺染色体的制片方法。2. 观察了解果蝇唾腺染色体的形态学及遗传学特征。二、原理本世纪初，D. Kostoff 用压片法首先在 D. melanogaster 果蝇幼虫的唾液腺细胞核中发现了特别巨大的染色体唾液腺染色体（salivary gland chromosome） 。事实上，双翅目昆虫（如摇蚊、果蝇等）的幼虫期都具有很大的唾腺细胞，其中的染色体就是巨大的唾液腺染色体。这些巨大的唾液腺染色体具有许多重要特征，为遗传学研究的许多方面，如染色体结构、化学组成、基因差别表达等提供了独特的研究材料。双翅目昆虫
15、的整个消化道细胞发育到一定阶段之后就不再进行有丝分裂，而停止在分裂间期。但随着幼虫整体器官以及这些细胞本身体积的增大，细胞核中的染色体，尤其是唾液腺染色体仍不断地进行自我复制而不分开，经过许多次的复制形成约 10004000 拷贝的染色体丝，合起来达 5m 宽，400m 长，比普通中期相染色体大得多（约 100150 倍） ，成交后代数目 反交后代数目表 型 合计 合计1 e + + +2 e + + sn3 e + m +4 e + m sn5 e w + +6 e w + sn7 e w m +8 e w m sn9 + + + +10 + + + sn11 + + m +12 + + m
16、 sn13 + w + +14 + w + sn15 + w m +16 + w m sn合计所以又称为多线染色体（polytene chromosome）和巨大染色体（giant chromosome） 。唾液腺染色体形成的最初，其同源染色体即处于紧密配对状态，这种状态称为“体细胞联会” 。在以后不断的复制中仍不分开，由此成千上万条核蛋白纤维丝合在一起，紧密盘绕。所以配对的染色体只呈现单倍数。黑腹果蝇的染色体数为 2n=24，其中第 II、第III 染色体为中部着丝粒染色体，第 IV 和第 I（X 染色体）染色体为端着丝粒染色体。而唾液腺染色体形成时，染色体着丝粒和近着丝粒的异染色质区聚于一
17、起表成一染色中心（chromocenter） ，所以在光学显微镜下可见从染色体中心处伸出 6 条配对的染色体臂，其5 条为长臂，1 条为紧靠染色中心的很短的臂。由于唾腺细胞在果蝇幼虫时期一直处于细胞分裂的间期状态，所以每条核蛋白纤维丝都处于伸展状态，因而不同于一般有丝分裂中期高度螺旋化的染色体。唾腺染色体经染色后，呈现深浅不同，疏密各异的横纹（band） 。这些横纹的数目、位置、宽窄及排列顺序都具有种的特异性。研究认为这些横纹与染色体的基因是有一定关系，而一旦染色体上发生了缺失，重复，倒位，易位等，也可较容易地在唾腺染色体上观察识别出来。唾腺染色体技术是遗传学研究中一项基本的技术。三、实验材料
18、黑腹果蝇三龄幼虫。四、器具和试剂双筒解剖镜、显微镜、镊子、小烧杯、解剖针、载玻片、盖玻片、滤纸。五、实验步骤1. 三龄幼虫的饲养黑腹果蝇容易饲养，也易获唾腺，但为获得理想的染色体制片标本，需要采用生长良好、形体肥大的三龄幼虫，以保证唾腺发育良好。所以饲养条件稍别于一般杂交饲养。（1）饲料要求松软，含水量较高，营养丰富，发酵良好。可采用下列配方：玉米粉 100g、红糖 130g、琼脂 10g、酵母粉 20g、苯甲酸 0.75g、丙酸 3ml、加蒸馏水1200ml。（2）在接种出现一龄幼虫后，将成虫移去，在饲料表面滴加低浓度的酵母液（2%4.5%的水溶液） ，每天滴加 12 滴。23 龄幼虫期适当
19、增加酵母液浓度（10%左右） 。滴加量以覆盖饲料表面一薄层为宜。（3）饲料营养对幼虫的发育固然重要，但幼虫密度过大亦会影响幼虫发育。故还需控制幼虫密度。这可通过控制成虫排卵时间来达到。一般情况下，牛奶瓶 10 对成虫交配后12 小时左右将成虫转移。（4）稍低的温度有利于幼虫的充分生长发育，因而可采用 1518培养。2. 唾腺染色体制片（1）检查幼虫培养瓶，取一适龄幼虫，置于载玻片上，并加上一滴生理盐水（如幼虫带有饲料可先用生理盐水洗净） ，置双筒解剖镜下检查。首先熟悉幼虫结构，幼虫具一钝尾和带黑色口器的尖头端。（2）在解剖镜下用两支解剖针，一针压住头部，压点尽可能靠头部口器处。因为幼虫会蠕动，
20、这一步需先练习几遍。（3）幼虫头部固定之后，再用另一针压住尾端（或用尖头镊子夹住） ，平稳快速一拉，使口器部分断开，体内各器官也从切口挤出，一对唾腺也随之而出。唾腺是一对透明的香蕉状腺体，仔细观察可发现由一个个较大的唾腺细胞组成。（4）分离的腺体可能伴有消化道和脂肪体。在载玻片上再加一滴生理盐水，确定取得了腺体后，再用刀片或镊子仔细剔除这些杂物，仅让腺体留下。或将腺体吸到干净玻片上。（5）用滤纸将多余的生理盐水吸去，注意不要碰着腺体，以防吸走。然后滴一滴醋酸洋红，染色 10 分钟。（6）染色后，盖上盖玻片，用滤纸轻轻吸去多余染液，然后放平在桌面，用大拇指压下盖片，可横向揉几下（注意不要使盖片滑
21、动，且只朝一个方向揉动，不要来回揉！） ，多练习几次，可望获得分散良好的制片。（7）制好的压片即可在显微镜下观察。亦可制成永久制片，步骤如下：置酒精：冰醋酸（3：1）固定液中固定，待盖片脱落后，再将有材料的载玻片和盖玻片通过下列顺序：95%酒精 1 分钟，纯酒精 1 分钟，再经纯酒精 1 分钟，取出载玻片，加一滴优巴拉尔（euparal）光学树胶，再取出盖玻片盖下，即可。六、实验结果检查你制作的制片，寻找形态良好、分散适中的图象仔细观察各条臂的特点。实验四 植物染色体压片法一、实验原理植物根尖的分生细胞的有丝分裂，每天都有分裂高峰时间，此时把根尖固定，经过染色和压片，再置放在显微镜下观察，可以
22、看到大量处于有丝分裂各时期的细胞和染色体。二、实验目的根尖染色体压片法，是观察植物染色体最常用的方法，也是研究染色体组型、染色体分带、染色体畸变和姊妹染色单体交换的基础。三、实验材料大蒜（Aillumsativum）、洋葱（Aillumcepa）的鳞基或蚕豆（Viciafaba）的种子。四、实验器具和药品1.用具：染色板，载玻片，盖玻片，指管，温度计，试剂瓶，滴瓶，镊子，解剖针，毛边纸。2.药品：无水酒精，70酒精，冰醋酸，对二氯苯或秋水仙素，醋酸钠，碱性品红，石碳酸，甲醛，山梨醇，纤维素酶，果胶酶，中性树胶或油派胶（Euparal），二甲苯。卡诺固定液的配制：用 3 份无水酒精，加入 1 份
23、冰醋酸（现配现用）。酶液的配制：以 0.1mol/L 醋酸钠为溶剂，配成纤维素酶（2）和果胶酶（0.5）的混和液。染色液的配制：配方.石碳酸品红（Carbol.fuchsin），先配母液 A 和B。母液 A：称取 3 克碱性品红，溶解于 100 毫升的 70酒精中（此液可长期保存）。母液 B：取母液 A10 毫升，加入 90 毫升的 5石碳酸水溶液（2 周内使用）。石碳酸品红染色液：取母液 B45 毫升，加入 6 毫升冰醋酸和 6 毫升 37的甲醛。此染色液含有较多的甲醛，在植物原生质体培养过程中，观察核分裂比较适宜，后来在此基础上，加以改良的配方，称改良石碳酸品红，可以普遍应用于植物染色体的
24、压片技术。配方：改良石碳酸品红取配方.石碳酸品红染色液 210 毫升，加入 9098 毫升 45的醋酸和1.8 克山梨醇（sorbitol）。此染色液初配好时颜色较浅，放置二周后，染色能力显著增强，在室温下不产生沉淀而较稳定。五、实验说明1.根尖由于取材方便，是观察植物染色体最常用的材料，有些植物种子难以发芽，或仅有植株而无种子，也可以用茎尖作为材料。2.植物细胞分裂周期的长短不尽相同，通常在十到几十小时之间，温度明显地影响分裂周期，对于一个不太熟悉的实验材料，最好在特定温度下长根，掌握有丝分裂高峰期，以便得到更多的有丝分裂的细胞。3.前处理的目的是降低细胞质的粘度，使染色体缩短分散，防止纺锤
25、体形成，让更多的细胞处于分裂中期，一般在分裂高峰前，把根尖放到药剂中处理34 小时。可处理的药剂很多，如秋水仙素、对二氯苯、8-羟基喹啉等。4.解离的目的是使分生组织细胞间的果胶质分解，细胞壁软化或部分分解，使细胞和染色体容易分散压平，解离方法有酸解法和酶解法。（1）酸解法是用盐酸水解根尖，步骤简便、容易掌握，广泛应用于染色体计数、核型分析和染色体畸变的观察。根尖分生组织经过酸解和压片后，都呈单细胞，但是大部分分裂细胞的染色体还包在细胞壁中间。（2）酶解法常用于染色体显带技术或姊妹染色单体交换等项研究，通过解离和压片，使分生细胞的原生质体，能够从细胞壁里压出，再经过精心的压片，使染色体周围不带
26、有细胞质或仅有小量细胞质，致使多项制片措施直接作用于染色体。六、实验步骤（一）将大蒜或洋葱的鳞基，置于盛水的小烧杯上，放在 25温箱中，待根长到 2cm 左右时，在上午九时摘下根尖，放到对二氯苯饱和水溶液，或0.02秋水仙素溶液中，浸泡处理 34 小时。（二）经过前处理的根尖，再放到卡诺固定液中，固定 24 小时。固定材料可以转入 70酒精中，在 4冰箱中保存，保存时间最好不超过二个月。（三）这里介绍两个解离方法，可以根据实验需要选择使用。1.酸解：从固定液中取出大蒜或洋葱根尖，用蒸馏水漂洗，再放到0.1mol/LHCl 中，在 60水浴中解离 810 分钟，用蒸馏水漂洗后，放在染色板上，加上
27、几滴改良石碳酸品红染色液，根尖着色后即可压片观察。2.酶解：取大蒜或洋葱的固定根尖，放在 0.1mol/L 醋酸钠中漂洗，用刀片切除根冠以及延长区（根尖较粗的蚕豆，可以把根尖分生组织切成 23 片），把根尖分生组织放到醋酸钠配制的纤维素酶（2）和果胶酶（0.5）的混合液中，在 28温箱中解离 45 小时，此时组织已被酶液浸透而呈淡褐色，质地柔软而仍可用镊子夹起，用滴管将酶液吸掉，再滴上 0.1mol/L 醋酸钠，使组织中的酶液渐渐渗出，再换入 45醋酸。酶解后的根尖，如作分带或姊妹染色单体交换，可用 45醋酸压片，如作核型分析或染色体计数等常规压片，可放在改良石碳酸品红中染色，经过酶处理的组织
28、染色速度快。（四）压片，把染色后的根尖放在清洁的载玻片上，用解剖针把根冠及延长区部分截去，加上少量染色液，并盖上盖玻片。一个解离良好的材料，只要用镊子尖轻轻的敲打盖玻片，分生组织细胞就可铺展成薄薄的一层，再用毛边纸把多余的染色液吸干，经显微镜检查后，选择理想的分裂细胞，再在这个细胞附近轻轻敲打，使重叠的染色体渐渐分散，就能得到理想的分裂相，要达到这个目的，必需掌握以下几点：1.压片材料要少，避免细胞紧贴在一起，致使细胞和染色体没有伸展的余地。2.用镊子敲打盖玻片时，用力要均匀，若在压片时稍不留意，使个别染色体丢失，而被迫放弃一个良好的分裂相的细胞。（五）封片。把压好的玻片标本，放在干冰或冰箱结冰器里冻结。然后用刀片迅速把盖玻片和载玻片分开，用电吹风把玻片吹干后，滴上油派胶加上盖玻片封片，或经二甲苯透明后，滴中性树胶，加盖玻片封片，做成永久封片。七、结果观察根尖染色体的分裂相。
