1、荧光定量PCR的原理及其应用,蒋昌龙,荧光定量PCR,Outline荧光定量PCR的原理荧光定量PCR应用,PCR 反应过程,d.NTPs,Taq 酶,Primers,反应组分,变 性,延 伸,重 复,退 火,循环24个拷贝,循环38个拷贝,Cycle #,PCR反应模式,同一样品96复孔的实验结果,荧光定量PCR 原理,缺憾 无法对初始模板精确定量 无法实时监测扩增情况 跑胶繁琐、易污染,常规PCR 电泳鉴定,荧光定量PCR在体系中引入荧光染料实时检测 扩增阶段：指数期平台期,荧光定量PCR 原理,荧光定量PCR 原理,Threshold line,C(t) value,阈值：荧光扩增曲线指
2、数增长期设定的一个荧光强度标准C(t)值：荧光信号到达阈值时所经过的扩增循环次数,荧光定量PCR 原理,X=X0(1+Ex)n,log X=log X0 (1+Ex)n,log X0= (- log(1+Ex) )*n+ log X,log X0= (- log(1+Ex) )*C(t) + log Xc(t),n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率,初始模板的Log10值与Ct值呈线性关系！,设定标准品，绘制标准曲线,荧光定量PCR 原理,Ct值,通过标准曲线对未知样品模板进行准确定量,荧光定量PCR 原理,荧光定量PCR 原理,两种定量方法 绝对
3、定量标准曲线法 相对定量双标准曲线法2 -c(t) 法,荧光定量PCR 原理,精确定量 大范围拷贝数样品同时检测 100 1010 省时有效,通过浓度梯度标准品，绘制标准曲线样品结果与标准曲线比对得到精确的浓度,临床检测，转基因检测，环境监测等,绝对定量,荧光定量PCR 原理,设置内标：b-actin、GAPDH等管家基因对靶基因进行均一化：靶基因拷贝每一个内标基因拷贝双标准曲线法 含靶基因与含内标基因的浓度梯度质粒分别做标准曲线；样本靶基因与内标基因绝对浓度的换算，并均一化处理；标本间靶基因的表达水平分析2 -c(t) 法标本内靶基因与内标基因Ct值比较：C(t) =C(t)m C(t)n标
4、本间C(t) 比较： c(t) C(t)1 C(t) 22 -c(t) 计算,相对定量,无需制备标准品(2 -c(t) 法)，需要内参照基因，注意扩增效率(内参与目的基因扩增效率相近）差异表达分析，芯片结果验证等,相对定量,荧光定量PCR 原理,插入染料法SYBR Green I 杂交探针法TaqMan,荧光定量PCR 原理,d.NTPs,Taq酶,Primers,反应组分,变 性,插入染料方法的原理,SYBR Green I,l,延 伸,检测激发的荧光,退 火,插入染料法相对成本低 不需要设计探针，通用性强对引物的设计要求较高（注意非特异性扩增） 不能做多重PCR,Melting Curve
5、 analysis,逐步提高温度，读取荧光值，得到温度与荧光值的关系曲线,Tm值：一半DNA解链时的温度,Solve the non-specific product,Melting curve,优化条件更换引物权宜之计,95 10sec60 15sec72 30sec80 10sec detection,40 cycles,杂交探针方法,TaqMan 探针 分子信标探针（Molecular Beacons）,荧光定量PCR 原理,TaqMan探针,d.NTPs,Taq酶,Primers,反应体系,变 性,l,退 火,1. 链取代,2. 水 解,3. 聚 合,4. 检测荧光,l,扩增特异性强
6、可以做多重检测成本较高,Molecular Beacon,发夹结构,退火时与靶片段结合 引物延伸时被切断,More,医疗领域的应用 科学研究方面的应用 公安系统内的应用 动植物检疫 考古学方面的应用 ,荧光定量PCR 应用,医疗方面的部分应用（1）： 临床检测： 疾病的临床早期诊断 如各种肝炎、性病、遗传性疾病、与优生优育相关的疾病以及肺结核等等 疗效考评 指导制订感染性疾病合理治疗方案 了解感染性疾病病人用药后病情的变化情况 医院、血站及防疫站的确诊,荧光定量PCR 应用,医疗方面的部分应用（2）： 遗传病诊断 ： 等位基因检测 多基因遗传病的突变检测 基因表达异常所致遗传病检测,荧光定量P
7、CR 应用,医疗方面的部分应用（3）： 肿瘤诊断 ： 肿瘤相关基因表达的检测 ：包括癌基因抗癌基因、肿瘤转移基因及转移抑制基因 肿瘤标志物 如癌胚抗原、同功酶、抗体、激素、细胞因子、受体等 肿瘤耐药基因（MDR）,荧光定量PCR 应用,研究方面的部分应用（1）： 分子生物学方面：研究各种处理对细胞mRNA含量变化的影响 比较染病组织与正常组织中各种mRNA含量差异DNA或RNA的转染量与实验结果关系的研究,荧光定量PCR 应用,研究方面的部分应用（2）： 植物学方面： 转基因植物中基因拷贝数与性状的关系 监测转基因植物中基因拷贝数的变化 转基因植株早期的筛选 监测农作物病虫害抗药性变化,荧光定
8、量PCR 应用,研究方面的部分应用（3）： 动物学方面： 动物疫情监测 新的防止疫情发生及控制的药物及方法的研究 转基因动物中目的基因拷贝数与品质的关系研究及早期筛选,荧光定量PCR 应用,其他方面的部分应用（1）： 进出口检验相关 ： 动物检疫，如各种动物流行病 植物检疫，如各种植物流行病 有害动物，特别是昆虫 食品检测，如各种有害病原微生物，如病毒、细菌、支原体 转基因植物检验，如转基因大豆、西红柿等,荧光定量PCR 应用,其他方面的部分应用（2）： 公安系统相关 ： 个人身份鉴定 物证的各种鉴定 人种的鉴定 考古方面 物种分类,荧光定量PCR 应用,据统计，目前中国有1015%的人感染有
9、HBV病毒人工受精前男性HBV检测 患者血清、精液的HBV检测,荧光定量PCR 应用,乙肝病毒HBV检测,检测方法,荧光定量PCR 应用,患者血清、精液 DNA的提取,酚/氯仿、试剂盒抽提,50C 5min 95C 10min 95C 15sec 60 C 40sec,40cycles,TaqMan Probe 0.25uMPrimer 0.9uMPCR buffer 1Template 50200ng,扩增HBV核心抗原core 基因,含core gene不同浓度梯度质粒为标准品,统计分析,荧光定量PCR 应用,检测结果,Amplification of standards,特异性强：使用了
10、Taqman probe 灵敏：检测下限达到了10 copies，,荧光定量PCR 应用,检测结果,血清中HBV含量比精液中高出两个数量级,使用TaqMan探针进行双通道荧光定量,Fam标记目标基因探针 VIC标记看家基因探针,荧光定量PCR 应用,ERBB2 的表达（正常组织vs. 肿瘤组织）,目标基因：ERBB2 oncogene 看家基因：GAPDH 模板 从 正常乳腺组织中提取的 Total RNA 从乳腺癌组织中提取的 Total RNA 含 ERBB2 and GAPDH 的质粒用于生成标准曲线,荧光定量PCR 应用,荧光定量PCR 应用,荧光定量PCR 应用,ERBB2 扩增曲线
11、,PMT1-FAM detection- ERBB2,PMT2-VIC detection- GAPDH,荧光定量PCR 应用,Healthy RNA,Tumor RNA,GAPDH,ERBB2,1095 1052,2130 2492,95500 85730,136000 130800,Copies ng/ l Total RNA,荧光定量PCR 应用,ERBB2 copies / GAPDH copies,1095 / 95500 = 0.011 1052 / 85730 = 0.012,2130/136000 = 0.017 2492/130800 = 0.019,Healthy RNA,
12、Tumor RNA,0.0115,0.018,Copies ng/ l Total RNA,荧光定量PCR 应用,0,0.2,0.4,0.6,0.8,1,1.2,1.4,1.6,1.8,2,Healthy Tissue,Carc. Tissue,Relative Expression,ERBB2的表达差异,荧光定量PCR 应用,荧光定量PCR 应用,胃癌早期诊断之SOCS-1高甲基化的检测,肿瘤抑制基因高甲基化而引起基因沉默是胃肿瘤发生的一个重要机制甲基化一般发生在基因的启动子区CpG中的C核苷酸SOCS-1 (suppressor of cytokine signaling-1)高甲基化与胃
13、肿瘤的发生具有密切联系,荧光定量PCR 应用,研究方法,胃癌患者血清DNA提取 （蛋白酶K、SDS、酚/氯仿、乙醇）,亚硫酸氢钠处理,DNA template SYBR supermixPrimers,定量PCR 体系,以 In vitro methylated DNA(IVD)为阳性对照（标准品）以非甲基化的胃癌细胞系KATO III为阴性对照以6个年龄、性别匹配的正常人血清做统计学分析,修饰非甲基化CpG为UpG甲基化位点不修饰,针对未经修饰改变的启动子序列,荧光定量PCR 应用,研究方法亚硫酸氢钠处理的血清DNA,94C 6min 94C 10sec 64C 25sec 72C 25se
14、c,77C 10sec Melting curve analysis,40cycles,定量PCR(SYBR),结果统计、临床意义分析,荧光定量PCR 应用,研究结果,Melt curve of real time MSP analysis of SOCS-1 gene,The standard curve of (in vitro methylated DNA, IVD) determined at 77C,荧光定量PCR 应用,研究结果,a In vitro methylated DNA b Results from duplicate experiment c Amount of met
15、hylated SOCS-1 as determined by Ct value,荧光定量PCR 应用,癌症患者血清中SOCS-1高度甲基化此方法诊断具有非侵入人体优点SOCS-1可作为胃癌早期诊断的指标之一,基因表达水平研究 基因的绝对表达量（微生物检测、环境监测）标本间基因的差异表达（病理相关、芯片验证） 基因型研究 基因单碱基变化（SNP、mutant）基因的碱基修饰（甲基化等）,荧光定量PCR 应用,More,HOW TO START OUR EXPERIMENT?,We need to decide what to start?,决定实验方案（绝对定量？相对定量？） 实验目的 决定选用实验方法 (SYBR green？TaqMan?)检测基因数、样本数 成本核算,We need Kits?,定量PCR试剂 SYBR Green I MixTaqMan Mix配套耗材TubesStripsPlate,Thank You,http:/www.gene- E-mail:changlong_,
