1、聚合酶链式反应（PCR）原理和应用,PCR原理与特点,PCR: Polymerase Chain Reaction聚合酶链式反应,一种选择性体外扩增DNA片断的技术广泛应用于生物医学的研究中是分子生物学的主流技术，是所有扩增技术中应用范围最广的一种技术。,PCR的操作过程,Step 1: 变性 Step 2: 退火 Step 3: 延伸,PCR 循环 第一步 变性 （使双链DNA解链为单链93-95 20-30秒）,PCR循环,PCR循环 第二步 退火 （温度由引物长度和GC含量决定，一般在55C左右。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。）,PCR循环,PCR循
2、环 第三步 延伸 （70-75,一般为72，延伸时间由扩增片段长度决定）,PCR循环,第一个 PCR 循环 靶序列完成复制,PCR循环,循环次数 DNA的链数1 21 22 22 43 23 810 210 102420 220 1,048,57630 230 1,073,741,824 10亿,PCR循环次数与DNA产量关系,PCR循环,PCR特点：高效扩增、忠实复制,主要取决于模版DNA的浓度，一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低，错误掺入率增加,理论上：Yn=Xn,J型,PCR循环,n,logYn,平台效应,在PCR的后期扩增产物增加的形式由呈指数方式变成平坦的曲线，同时出现大量的
3、非特异性扩增，这种现象称为平台效应。,随着反应的进行，dNTP和引物的浓度不断降低随着产物的增加，酶对模板的比率降低由于解链温度较高，多次循环后酶的活性和dNTP的稳定性逐渐降低反应体系中产生的非特异性产物或引物二聚体与反应底物竞争聚合酶反应产物在高浓度时变性不完全，影响引物的延伸酶与PCR的产物结合，使酶分子减少因此我们要控制PCR的循环次数在合理的范围内，使 反应在指数扩张期内完成。,PCR反应体系 模板(DNA or RNA) DNA 耐热聚合酶(Taq polymerase) 一对引物 脱氧核苷酸（dNTPs） 反应缓冲体系(reaction buffer)PCR促进剂,模板的要求,纯
4、化处理以去除DNA聚合酶抑制剂 含有目标靶序列的模板DNA可以通过单链或双链的形式加入PCR的反应体系 环状DNA的复性太快，故常用线性DNA分子 小片段模板DNA的扩增效率要高于大分子 适宜的模板量,PCR扩增产物的大小及扩增靶序列在基因组中的位置是由引物限定的，因此，引物的选择关系到PCR的特异性。,引物必须是高质量而且需要纯化 寡聚核苷酸的长度越长，获得的特定靶序列的特异性就越好（一般为15-30个核苷酸，但最多不超过70个核苷酸。） G+C的含量一般为40%-60%，四种碱基应随机分布，避免碱基堆积的现象 引物自身不应有反向重复序列或者大于3bp的自身互补序列，否则引物会自身折叠，形成
5、发夹结构 引物之间不应有互补序列，以免形成引物二聚体,引物的设计,引物的3端是引发延伸的起点，一定要与模板准确配对 引物的5端无严格的限制，但不可与模板DNA互补而成游离状态 3端引物和5端引物应有相似的Tm值 引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个碱基同源 引物3端应为保守的氨基酸序列，既采用简并密码较少的氨基酸,灵敏度高 快捷 简便 对样品纯度要求低 可以相对定量,PCR反应的特点,检验PCR扩增效率的三个指标是： 特异性、有效性、忠实性,特异性是指PCR扩增产物的一致性 忠实性是指扩增产物的序列与模板DNA的序列相符合的程度 理想的PCR应该是高度特异和忠实的，然而由于常
6、用的耐热DNA 聚合酶没有校正阅读功能，所以仍然会出现碱基错配的现象。,PCR扩增产物的分析方法,1、凝胶电泳分析法琼脂糖凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳 2、核酸探针杂交法 3、酶谱分析法 4、PCR-ELISA法 5、DNA酶免疫试验法 6、荧光PCR法,主要PCR类型,常规PCR 荧光定量PCR 原位PCR RTPCR 多重PCR PCRSSO 和 PCRSSP,1.原位PCR (in situ PCR)把原位杂交的细胞定位技术与PCR扩增相结合的技术，既通过PCR技术以DNA为起始物，对靶序列在染色体上或组织细胞内进行原位扩增，使其拷贝数增加，然后通过原位杂交方法检测，从而对靶核酸进行定性
7、定量定位分析。主要用于基因的细胞定位、组织分布和基因表达的检测。2.反转录PCR （RTPCR）以mRNA为模板，通过反转录产生的cDNA为模板进行PCR扩增,3.多重PCR (multiplex PCR)多对引物在同一个PCR反应体系中同时扩增几个不同靶区域的PCR扩增技术4.PCRSSP 和 PCRSSO特异性引物PCR (PCR-SSP):采用序列特异性引物进行PCR扩增的基因多态分析技术，主要用于多态性基因的分型特异性探针PCR (PCR-SSO)通过基因特异性的寡核苷酸探针与PCR扩增产物杂交,反转录PCR,先以RNA为模板，在逆转录酶作用下合成cDNA； 然后以cDNA为模板，在D
8、NA聚合酶的作用下扩增特定目的基因 通常用于检测特定基因mRNA在样本中的表达水平,RT-PCR,荧光定量PCR原理 Fluorescence Quantitative PCR,在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法。以外参或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，对PCR起始模板量进行定量。,FQ-PCR,荧光探针：TaqMan、 Hybridization Probes 、Molecular Beacon 荧光染料：SYBR Green I、Eva Green,结果,每产生一条DNA链，就切断一条探针每切断
9、一条探针，就产生一个荧光信号信号强度与结合探针的DNA分子数成正比,FQ-PCR,PCR循环,定量PCR与定性PCR的本质区别,常规PCR技术的不足,操作相对复杂，不安全 扩增产物污染引起的假阳性 只能定性不能定量 不能揭示核酸水平与疾病发生发展的相关性,一、闭管化学，污染机会少。 二、实现真正的样本核酸准确定量。 三、宽广的动力学范围，无需梯度稀释。 四、探针使用，特异性更强。 五、光谱分析，敏感性更高。 六、高度自动化， 操作简单，无需后处理。,荧光定量PCR主要优点,荧光阈值 (threshold ) 荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上
10、，一般将 PCR反应前 15个循环的荧光信号作为荧光本底信号（基线），荧光阈值是PCR 315个循环荧光信号标准差的10倍，荧光阈值设定在 PCR扩增的指数期。,FQ-PCR,与结果分析相关的两个重要概念： 荧光阈值与Ct值,Ct 值 (Cycle，threshold )每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数被称为 CT 值（ threshold value ）。表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。,Ct值的意义,Ct值与重复性 同一样本在相同条件下同时进行96次扩增,FQ-PCR,Ct值与浓度 不同的模板达到荧光域值时的Ct值不同,Ct值 原始拷贝数
11、?,研究表明，各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小。反之亦然。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标难曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数。纵坐标代表CT值。因此，只要获得未知样品的CT值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。,FQ-PCR,PCR常见问题分析,问题一：无扩增产物,模板:含有抑制物，含量低 Buffer对样品不合适 引物设计不当或者发生降解 反应条件：退火温度太高，延伸时间太短,纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量 更换Buffer或调整浓度 重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物 降低退火温度
12、、延长延伸时间,现象：阳性对照有条带，而样品则无；,原 因,对 策,现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。,PCR常见问题分析,问题二：非特异性扩增,引物特异性差 模板或引物浓度过高 酶量过多 Mg2+浓度偏高 退火温度偏低 循环次数过多,对 策,重新设计引物 适当降低模板或引物浓度 适当减少酶量 降低镁离子浓度 适当提高退火温度或使用二阶段温度法 减少循环次数,问题二：非特异性扩增,原因,现象：产物在凝胶上呈Smear状态。,M 1 2,PCR常见问题分析,问题三：拖尾,模板不纯 Buffer不合适 退火温度偏低 酶量过多 dNT
13、P、Mg2+浓度偏高 循环次数过多,对 策,纯化模板 更换Buffer 适当提高退火温度 适量用酶 适当降低dNTP和镁离子的浓度 减少循环次数,问题三：拖尾,原因,问题四：假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况),M 1 2 H2O,PCR常见问题分析,现象：空白对照出现目的扩增产物,问题四：假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况),原因,靶序列、扩增产物或引物的交叉污染,对 策,操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外； 重新设计引物；采用灭菌水配置引物；采用灭菌的器材。 各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。,污染的原因,样品间交叉感染 PCR试剂的污染 PCR扩增产物的污染
14、最主要最常见的污染 实验室中克隆质粒的污染,PCR技术中污染问题,防止污染的方法,合理分隔实验室 微量移液器（吸样枪） 预混合分装PCR试剂 防止操作人员污染 设立适当的阳性对照和阴性对照 减少PCR循环次数，PCR产物达到检测水平就适可而止 选择质量好的Eppendorf管 使用尿嘧啶DNA糖基化酶,PCR在生物医学研究中的应用,1)构建cDNA文库mRNA提取-反转录合成单链cDNAPCR扩增cDNA克隆 2)基因突变检测基因突变包括点突变、插入、缺失、重排和基因扩增等方法包括：PCR-SSO, PCR-SSCP, PCR-RFLP, 3)基因表达量检测用于检测细胞中基因表达量的测定常用方
15、法：荧光定量PCR,PCR技术在生物研究中的应用,4)DNA序列多态性分析通常指单一基因位点上不同个体间等位基因的多态性以及单核苷 酸多态性常用方法：PCR-SSO, PCR-RFLP, PCR-DHPLC 5)DNA片断长度多态性分析通常指单一基因位点上，不同个体间等位基因片段长度的不同， 主要分为VNTR(variable number of tandem repeats)和 STR(short tandem repeat),PCR技术在生物研究中的应用,1)传染性病原体的检测 2)遗传病的分子诊断 3)肿瘤的诊断和疗效检测 4)血库血液筛查 5)药物遗传学和个体化治疗方案,PCR技术在临
16、床医学的应用,荧光定量PCR在病原体检测中的应用,一、肝炎病毒定量检测 二、性病病原体检测 三、结核杆菌及呼吸道病原体检测 四、优生优育(TORCH)相关项目检测,临床应用,遗传病分子诊断的应用范围,产前诊断(prenatal diagnosis)新生儿筛查(newborn screening)携带者筛查(heterozygote screening or carrier screening)遗传预测(presymptomatic screening or predictive screening),荧光PCR的作用：可对原癌基因的突变和易位等作出检测； 可对原癌基因的mRNA进行定量分析； 有利于肿瘤的早期诊断，甚至癌前诊断； 探索癌变发生机理的研究提供参考； 区别肿瘤的良性和恶性以及炎症反应。,肿瘤的诊断,药物代谢酶多态性：细胞色素P450药物转运蛋白多态性：P糖蛋白药物作用靶位多态性：肾上腺素能受体,药物遗传学检测,1.亲子鉴定2.法医物证3.PCR-RFLP技术的法医学应用4.罪犯鉴定,法医鉴定,谢谢各位！,
