1、荧光定量 PCR技术的原理及其应用 基因有限公司 技术支持部 张会敏 实时荧光定量 PCR 实时荧光定量 PCR （ real-time Q-PCR ）技术 :指在 PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个 PCR进程，最后通过参照标准曲线对反应体系中未知模板进行量化分析的方法。 定量 PCR技术的产生 1992年由 Higuchi等人第一次报告：使用 EB内插染料法插至双链 DNA， 经改装的带有冷 CCD的 PCR仪检测样品的荧光强度，后来用与双链 DNA有更强结合力的染料 SYBR Green I取代 EB 90年代早期，发现 Taq DNA多聚酶具有 5核酸外切酶活性
2、，能在 DNA双链聚合过程中降解与模板互补的 DNA片段（如特异性探针），因此使得间接的检测 PCR产物成为可能。此后荧光双标记探针的运用使在一密闭的反应管中能实时地监测反应全过程。 这些发现以及相应的仪器和试剂的商品化发展导致 real-time Q-PCR方法在 研究工作中的运用。 PCR循环 双链 DNA 染料 荧光 PCR的 理论方程： Y=x (1+ Ev)n Y：扩增物数量； X ：起始模板数量； Ev： 扩增效率 ； n：扩增循环数 1. 终点法定量原理： 在最佳实验、循环次数 n一定、 Ev相同的前提下，根据 扩增产物的量 可以计数出反应物中原始分子数，若核酸提取效率相同（与标
3、准品），进而计算出标本中靶分子的准确含量，即： lnX=lnY-n ln(1+Ev)=lnY - b (b为常数 ) 2. 实时检测法定量原理： 在最佳实验、相同 Ev以及相同扩增产物的情况下，反应物中原始分子数（ X）与其所需要的 扩增循环次数（ n） 成反比，若核酸提取效率相同（与标准品），进而计算出标本中靶分子的准确含量，即： LgX=LgYn Lg(1+Ev)=b - n a (a、 b为常数 ) 传统检测起始模板的定量方法是 终点检测法 ，即 PCR快到达平台期进行检测，而不同起始模板浓度经过 PCR对数期扩增到达平台期时，最后的差异极小，不仅检测不准确，而且 检测重现性很差。 同一
4、个模板在 96孔PCR仪上做 96次重复实验，所得结果有很大差异，因此无法直接从终点产物量准确推算出起始模板量。 实时荧光定量 PCR技术 则是根据不同浓度的起始模板经 PCR扩增后到达某一定值时所需要的循环数来计算起始模板量，克服终点法检测过程中“ 平台效应 ”对结果的影响。检测每一轮循环的荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品 Ct值的计算，根据标准曲线即可获得定量的准确结果。 实时荧光定量 PCR中的三个概念 增长曲线 (primary curve) 荧光阈值（ threshold) CT 值 (Cycle Threshold) 增长曲线 反映荧光强度与循环数的对应关系 C
5、ycle Fluorescence 域值 ： PCR扩增信号进入相对稳定对数增长期时的荧光值。 PCR反应的前 15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是 3-15个循环的荧光信号的偏差的 10倍。 荧光域值（ Threshold）的设定 确定 Ct值 Ct值 :C代表 Cycle， t代表 threshold， Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。 PCR循环在到达 Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此 Ct值的重现性极好， 即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的 Ct值是恒定的
6、. 当循环次数 n=Ct时： X= X0 (1+Ex)Ct 两边取对数，可以推倒出： Ct值与起始模板的关系 logN=log N0 +nlogE n=Ct Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的 Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表 Ct值。因此，只要获得未知样品的 Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 Interpolation of real time graphical data to standard curve CT值取决于阈值 ，阈值取决于基
7、线，基线取决于实验的质量，因此 CT值是一个完全客观的参数。 CT值越小，模板 DNA的起始拷贝数越多； CT值越大，模板 DNA的起始拷贝数越少。 一般正常的 CT值范围在 15-35之间，过大和过小都将影响实验数据的精度。 通过标准品作出标准曲线，根据样品 Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量 实时在线监控 对样品扩增的整个过程进行实时监控，能够实时地观察到产物的增加 降低反应的非特异性 引物和荧光探针同时与模板特异性结合，提高反应的特异性 增加定量的精确性 准确的算法进行定量 结果分析更加快捷方便， 无需跑胶 荧光定量 PCR与普通 PCR的比较 荧光定量 PCR标记方法 内掺式染料
8、SYBR Green I 、 LC Green、 Eva Green 序列特异性探针 Taqman Molecular Beacons Dual Probes(FRET) 引物特异性探针 Amplifluor (Intergen) 5 3 5 3 SG Excitation SG SG SG SG Emission SYBR-Green I 5 3 5 3 5 3 5 3 SG SG SG SG SG Emission Emission Excitation Excitation SYBR Green I 应用范围： 起始模板浓度定量 溶解曲线分析 可区分单一产物、变异产 物、多种产物和引物二
9、聚体 基因型分析 优点： 使用方便，可以应用于不同的模板 灵敏，便宜 缺点： 与非特异性产物结合，通过熔解曲线进行辨别 温度 荧光强度 Tm Tm值： DNA解链一半时的温度 溶解曲线分析 将温度对荧光强度的变化求导。 (-dI/dT) 溶解曲线分析 融解曲线分析，单一峰 无非特异性荧光 定量准确 融解曲线分析，出现杂峰 其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确 Melt by Sybr Green DNA片断长度特异性 HRM(High Resolution Melt) by Lc Green DNA长度特异性 碱基特异性 SYBR melts can reflect product siz
10、e 250 bp fragment 500 bp fragment Raw data plot: fluorescence vs. temp. Derivative data plot: dF/dT vs. temp 500 bp fragment 250 bp fragment SYBR Green I 是一种 PCR抑制剂，使用时浓度不能太高，在熔解过程中有可能重新与还未解链的 DNA结合 HRM Saturation Dyes SYBR Green I LC Green I LC Green等染料对 PCR抑制作用较小，可以饱和浓度存在 Herrmann et al. 2006 As a
11、 model analytical target, the sickle cell mutation was chosen. The sickle cell mutation in the -globin gene is an AT transversion in the second nucleotide of codon 6. A 110-bp PCR product including this mutation with a predicted Tm difference between homozygotes (AA and TT) of 0.09 C provides a stri
12、ngent test for differentiation. Furthermore, the heterozygous AT genotype provides a convenient sample to assess the quality of mutation scanning by melting. Both homozygote resolution (AA vs TT) and heterozygote scanning (AA vs AT) were studied with either SYBR Green I or LCGreen Plus as fluorescen
13、t indicators of DNA melting. Melt comparison: LCGreen I vs. SYBR Green I Derivative melting curve plots of a molecular size ladder (inset) using either SYBR Green I (gray line) or LCGreen (black line) From: High-Resolution Genotyping by Amplicon Melting Analysis Using LCGreen Carl T. Wittwer, Gudrun
14、 H. Reed, Cameron N. Gundry, Joshua G. Vandersteen, and Robert J. Pryor. Clinical Chemistry 49:6, 853860 (2003) HRM workflow on the Rotor-Gene 6000 Autocall genotypes Up to 100 at a time Choose preferred tube 0.1 mL tubes Gene-Disc 72 0.2 mL tubes Gene-Disc 100 Run PCR and HRM HRM Profile 0.02deg HR
15、M on the Rotor-Gene 6000 高灵敏度的光学系统 精确的控温方式 高精度的温度分辨率（ 0.02 /S） 高强度的荧光采集速率（ 1000次 / ） 功能强大的分析软件 M u t a n t s( T a l l e l e )W i l d t y p e s( C a l l e l e )H e t e r o z y g o t e sTemperature ( C) Fluorescence82 83 84 85 86 87 88 Example SNP genotyping using HRM analysis. ACTN3 (R577X) SNP genotypes (C T). Ten replicates each genotype are shown. Fragment pre-amplified using a 40 cycle fast protocol (40 min). 突变体筛选 SNP分析 基因型分析 DNA甲基化分析 微卫星分析 HRM技术的应用
