1、PCR技术原理及其应用,1 PCR技术原理 2 PCR技术应用,第一节 PCR技术原理,一、PCR技术简史,DNA的复制 聚合酶链反应的发明,PCR技术简史,DNA的复制 聚合酶链反应的发明,引物酶,引物酶,PCR技术简史,DNA的复制 聚合酶链反应的发明,DNA 聚合酶,DNA 聚合酶,PCR技术简史,DNA的复制 聚合酶链反应的发明,PCR技术简史,DNA的复制 聚合酶链反应的发明,Kary B. Mullis,1989年美国Science杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。,引物,引物,Mullis的构思,DNA
2、聚合酶,DNA聚合酶,特定DNA片段,Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus),酶活性(%),温度(),40 50 60 70 80 90 100,10080604020,72,94,55,PCR循环,二、PCR的基本原理,类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。,PCR Cycle - Step 1 - Denaturation Template
3、 DNA by Heat (95oC),Target Sequence,Target Sequence,PCR原理示意图,模板DNA的变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；,PCR Cycle - Step 2 Temperature is lowered (Tm ) and primers anneal to target sequences,Target Sequence,Target Sequence,Primer 1,Primer 2,5,3,5,5,3,5,3,3,模板DNA与
4、引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；,PCR Cycle - Step 3 - At 72 o C Taq DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporated,Target Sequence,Target Sequence,Primer 1,Primer 2,5,3,5,5,3,5,3,3,Taq DNA Polymerase,引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP
5、为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链。,End of the 1st PCR Cycle Results in two copies of target sequence,Target Sequence,Target Sequence,每完成一个循环需24分钟， 23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。,Target Amplification,No. of No. Amplicon Cycles Copies of Target 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 20 1,048,576 30 1,073,741,824,
6、1 cycle = 2 Amplicon,2 cycle = 4 Amplicon,3 cycle = 8 Amplicon,4 cycle = 16 Amplicon,5 cycle = 32 Amplicon,6 cycle = 64 Amplicon,7 cycle = 128 Amplicon,三、PCR反应,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,PCR仪,PCR反应,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,PCR反应,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,重复13步 2530轮,目的DNA片段 扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链 与引物复性,DNA变性 形成2条单
7、链,子链延伸 DNA加倍,模板DNA,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,引物1,引物2,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,第1轮结束,第2轮开始,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,第2轮结束,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,模板DNA,第1轮扩增,第2轮扩增,第3轮扩增,第4轮扩增,第5轮扩增,第6轮扩增
8、,理想拷贝数=2nn 循环次数实际拷贝数=(1+x)nX 平均效率,约为0.85n 循环次数,PCR反应,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,以DNA为模板的反应 反应体积：50100l 缓冲液 引物 底物：4种dNTP 模板：102105拷贝 TaqDNA聚合酶 矿物油,四、PCR反应体系,以mRNA为模板的反应（逆转录PCR）逆转录反应体系 体积：20 l 缓冲液 底物：4种dNTP 引物：oligo(dT)1218 模板：RNA 逆转录酶 其他试剂：RNA酶抑制剂， MgCl2.DTT.牛血清白蛋白PCR反应体系同以DNA模板的反应体系,（一）PCR反应成分,（1）模板单、双链DN
9、A均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。一般100ng DNA模板/100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。,（2）引物浓度0.1-0.5 mol/L浓度过低影响产量，偏高引起错配和非特异性产物增加，且可增加引物二聚体的产生几率。 （3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)0.5-2.5 U/50 l酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。,（4）dNTP 20200mol/LdNTP浓度取决于扩增片段的长度四种dNTP浓度应相等浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量，但特异性增加dNTP可与Mg2+结合，使游离
10、的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。,（5） Mg2+,Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。 0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。 Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。,1050mmol/L Tris-Cl 缓冲液，72 时pH 7.2,调节反应体系的pH值，使Taq DNA聚合酶的作用环境维持偏碱性。缓冲液含50 mmol/L的KCl可促进引物退火，大于此浓度将会抑制TaqDNA聚合酶的活性。加入适量二甲基亚砜或甲酰胺有利于破坏模板的
11、二级结构。,（6） PCR反应的缓冲液,（二）循环参数 （1）变性 94oC95oC，30-60 s且最初在加Taq酶之前先于97oC充分变性510min （2）退火 50oC55oC，60-90 s增加温度能减少引物与模板的非特异性结合; 降低温度可增加反应的灵敏性。,（3）延伸70oC74oC，60-120 s延伸时间由扩增片段长度决定 （4）循环次数主要取决于模板DNA的浓度，一般为25-35次次数过多：非特异扩增增加,（三）PCR产物的积累规律,在PCR反应中，DNA扩增过程遵循酶的催化动力学原理。反应初期，目的DNA片段呈指数扩增。随着目的DNA产物逐渐积累，扩增DNA片段的增加减慢
12、进入相对稳定状态，即出现“停滞效应”，又称“平台期”。到达平台期所需PCR循环次数取决于样品中模板的拷贝数、PCR扩增效率、DNA聚合酶种类和活性、以及非特异产物的竞争等因素。到达平台期前，TaqDNA聚合酶一般要进行25次以上PCR循环。多数情况下，平台期在PCR反应中不可避免。,PCR产物的积累规律示意图,（一）一般原则 引物长度在1530碱基。引物过短，会使特异性降低。过长会提高相应的退火温度，且合成引物的成本增加。 引物中碱基的分布是随机的，避免4个以上的嘌呤或嘧啶的连续排列，G+C含量宜在4555左右。,五、PCR引物的设计,避免两引物间的互补，特别是3端互补，以免形成二聚体。引物自
13、身不应存在连续超过3bp的互补序列， 否则引物自身会折叠成发夹结构或引物本身变性。,引物的3端不能有任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能。引物的5端限定着PCR产物的长度，可根据产物的要求不同， 可以选用不同的引物修饰法。,引物与非扩增序列的同源性不应超过70。,直接提交模板序列到特定网页。如：http:/genome-www2.stanford.edu/cgi-bin/SGD/web-primer; http:/frodo.wi.mit.edu/ 引物设计软件。功能：首先是引物分析评价功能，其中以“Oligo 6”最为优秀；其次是引物的自动搜索功能，各种软件在这方面的侧重点不同。,（二）
14、引物设计的方法,六、PCR产物的检测,（一）琼脂糖凝胶电泳是PCR扩增产物的分离、纯化和鉴定最常用的方法。其分辨率很高，可测出1ng DNA。一般800bp以上的片段用0.8%的胶，800bp以下的片段用1.0%2.0%的胶。,灵敏度比琼脂糖凝胶电泳高，主要用于分离制备小于1kb长度的低分子质量基因片段，因此特别适用于合成的基因片段的分离和检测。适用于PCR扩增效率低时产物的检测。根据扩增片段的大小选择合适的胶浓度，电泳后可用银染或溴乙锭染色检测，银染比EB染色检测灵敏度高210倍。,（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳,高效液相色谱(HPLC)是在常压基础上发展起来的一项现代化分析技术，其特点是分离速度
15、快、效果好，是目前基因片段分离纯化所广泛采用的方法之一。离子交换层析（ IEC ）的基础是溶质分子所携带的电荷，而合成的基因片段恰好具有这一性质。因此，IEC分析广泛应用于DNA的合成及其扩增后的分离纯化。,（三）层析技术,为了确定PCR产物是否是预先设计的目的片段，或产物是否有突变，都需做分子杂交检测。分子杂交包括点杂交和Southern印迹杂交。点杂交灵敏度较高，特别适用于特异性不高的PCR扩增产物分析。Southern印迹杂交可鉴定PCR产物的大小和特异性，检测灵敏度可达10ng。基本过程是PCR产物进行常规的琼脂糖凝胶电泳，然后，印迹转移到尼龙膜上，再用标记的探针进行杂交检测。,（四）
16、分子杂交,若知道PCR扩增片段的序列或限制性内切酶酶切图谱，则可选择合适的限制酶消化PCR产物，再进行电泳分析，根据PCR酶切产物的电泳图谱，可判定PCR产物的特异性及是否存在突变。（六）PCR扩增产物的直接测序直接序列分析是指在PCR扩增基因组DNA序列的基础上，直接进行基因核苷酸序列分析的方法，是检测基因突变最有效、最直接的方法。,（五）限制性内切酶酶切分析,七、PCR中应注意的事项,（一）防止污染 试剂小量分装 吸头及Ep管一次性使用 器皿及工作区域要分开，无菌操作 （二）设立对照： 阳性对照：阳性模板 阴性对照：阴性模板 试剂对照：除模板外的所有组分,八、PCR常见问题,无扩增产物 非
17、特异性扩增 拖尾 假阳性,第二节 PCR技术应用,一、PCR技术的主要类型,反向PCR 锚定PCR 不对称PCR 原位PCR RT-PCR 重组PCR 差异显示PCR 免疫PCR 实时定量PCR 多重PCR,1)反向PCR (reverse PCR),是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段，对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。,已知序列,未知序列,未知序列,限制酶,限制酶,连接酶,2）不对称PCR目的：扩增产生特异长度的单链DNA。方法
18、：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.010.5M,关键是限制性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板制备杂交探针基因组DNA结构功能的研究,高浓度引物,低浓度引物,3）RT-PCR是以反转录的cDNA作模板所进行的PCR反应,用于测定基因表达的强度和鉴定已转录序列是否发生突变,呈现mRNA多态性,克隆mRNA的5和3末端序列，以及从非常少量的mRNA样品构建大容量的cDNA文库。,mRNA,cDNA,杂化双链,基因,mRNA,蛋白质多肽链,4）多重PCR：在一个反应体系中使用一对以上引物的PCR称为多重PCR。其结果是产生多个PCR产物，用于检
19、测特定基因序列的存在或缺失。,电泳,引物,5）实时荧光定量PCR,real-time PCR，美国PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术，该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针来实现其定量功能的，与普通PCR相比，实时定量PCR具有许多优点。,原理和方法 利用Taq酶的53外切酶活性，在PCR反应系统中加入一个荧光标记探针。该探针可与引物包含序列内的DNA模板发生特异性杂交，探针的5端标以荧光发射基团FAM（荧光发射峰值在518nm处），靠近3端标以荧光淬灭基团TAMRA（荧光发射峰值在582nm处），探针的3端被磷酸化以防止探针在PCR扩增过程中被延
20、伸。当探针保持完整时，淬灭基团抑制发射基团的荧光发射。发射基团一旦与淬灭基团发生分离，抑制作用被解除，518nm处的光密度增加而被荧光探测系统检测到。复性期探针与模板DNA发生杂交，延伸期Taq酶随引物延伸沿DNA模板移动，当移动到探针切断,淬灭作用被解除，荧光信号释放出来.模板每复制一次，就有一个探针被切断，伴随一个荧光信号的释放。由于被释放的荧光基团数目和PCR产物数量是一对一的关系,因此用该技术可对模板进行准确定量。,实时PCR技术原理,荧光探针设计遵循原则： 探针长度应在2040个碱基左右，保证结合特异性。 GC碱基含量在40%60%，避免单核苷酸序列的重复。 避免与引物发生杂交或重叠
21、。 探针与模板结合稳定程度要大于引物与模板结合的稳定程度，因此探针的Tm值要比引物的Tm值至少高出5。 另外，探针的浓度、探针与模板序列的同源性，探针与引物的距离都对实验结果有影响。,特 点FQ-PCR不仅具有普通PCR的高灵敏性，而且由于荧光探针的应用，可以通过光电传导系统直接探测PCR扩增过程中荧光信号的变化以获得定量结果，所以还具有DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确性，克服了常规PCR的许多缺点。FQ-PCR只须在加样时打开一次盖子，其后的过程完全是闭管操作，不需要PCR后处理，避免了常规PCR操作中的诸多弊端。,1 病原体测定 由于PCR技术的问世，使得病原体检测能够快速而方便的进
22、行。但由于其高灵敏性，实验操作很容易受到污染而出现假阳性。只要有微量病原体存在，PCR扩增即可为阳性结果，但并不能作为诊断依据，只有当一定数量的病原体存在时才有临床意义，因此结模板定量显得特别重要。常规PCR由于不能定量而限制了其应用，然而PE公司研制的FQ-PCR技术给解决这一问题提供了可能。目前该技术已经应用于丙肝病毒、人类乳头瘤病毒、结核杆菌和食品中大肠杆菌等许多病原体的检测研究。 Morris等用FQ-PCR对黑猩猩丙型肝炎动物模型和临床丙型肝炎患者血清中丙肝病毒（HCV）进行了研究。FQ-PCR技术在保持巢式PCR高度敏感性的同时又能提高效率，因此可作为一种检测HCV的有效方法。同时
23、，由于FQ-PCR可以测出血清中病原体浓度，故可给药物治疗及疗效观察提供参考依据。,以前常规检测大肠杆菌的方法，都因为繁琐，需要大量的PCR后处理过程及不能对标本定量而受到限制。美国Witham等1996年将FQ-PCR技术应用于牛肉中大肠杆菌志贺氏毒素基因的检测研究。针对不同血清变异型的大肠杆菌，他们设计应用不同的探针，从而提高了实验特异性。他们同时还对探针相对于引物的位置、反应液中探针浓度、镁离子浓度等影响实验的因素进行了优化实验，以提高实验的准确性和精确性。由于TaqMan系统可以一次测量96管样品，还可对模板进行准确定量，又不需要进行电泳及EB染色后处理过程，实际应用方便，从而提高了实
24、验的参考价值和应用价值。因此该实验方法是食品检测方面的一个突破。,2. 肿瘤研究意大利Gelmini等用FQ-PCR技术检测乳腺癌标本c-erbB-2基因拷贝数目变异情况。他们以-肌动蛋白基因为参照探索最佳实验条件，当扩增循环数在2831之间时，RQ与模板DNA有着较好的剂量依赖关系。他们在此条件下扩增了c-erbB-2基因和-球蛋白基因，发现RQ都与各自的模板DNA浓度存在着线性关系，虽然二者斜率不同，但是各个实验浓度下二者的RQ之比却是恒定的。说明尽管二者发光效率不同，却不影响定量效果。他们将实验数据与Southern印迹结果和已报告的竞争性PCR结果比较都显示高度相关性（n=25，r=0
25、.94，P0.01）。,3. 基因表达研究由于TaqMan系统及荧光探针的应用，对mRNA的检测显得较以前常用的方法如Northern印迹、RT-PCR定量法要方便、快速、准确得多。为了探测骨髓基质血小板生成因子（TPO）在巨核细胞生成过程中的作用以及血小板生成因子在特发性血小板减少性紫瘢（ITP）、再生障碍性贫血（AA）和特发性血小板多症（ET）等疾病过程中的病理生理意义，日本Hirayama等用TaqMan EZ RT-PCR试剂盒在ABI7700反应系统测定了正常人和ITP、AA、ET病人的骨髓基质细胞TPO mRNA水平，又用ELISA方法测定了骨髓和末梢血的TPO浓度。结果显示ITP
26、和AA病人TPO mRNA水平明显升高，而ET病人的TPO mRNA水平则正常，经类固醇治疗后ITP病人TPO mRNA水平下降；骨髓TPO的浓度与其 mRNA水平有相关性；在正常人和ITP病人，TPO mRNA表达水平与巨核细胞计数也有相关性。这个实验对阐明TPO 的作用提供了依据。,4. 免疫组份分析 对免疫T细胞群体V-组份进行分析是研究健康和疾病免疫应答反应的重要手段，可通过流式细胞法或RFQ-PCR法来进行。1997年Lang等用FQ-PCR技术进行实验，他们在反应系统中引入荧光探针，将下游引物与探针固定，然后，针对不同的V-成份，选用特异的上游引物进行扩增，再对反应中产生的荧光信号
27、进行处理，即可获得各个成份的数据。,5. 基因突变及多态性的研究美国Ibrahim等1997年用FQ-PCR技术对正常痘病毒多态性进行了研究。他们采用一对可与正常痘病毒血凝素基因的某一DNA片段结合的引物，并设计两个有单核苷酸差异的寡核苷酸探针，用荧光标记后进行实验，顺利地把有此单核苷酸差异的两个痘病毒株进行鉴定。该技术也可用于猴痘和病毒DNA疫苗的单核苷酸变异多态的研究。,6. 其他方面日本Isono利用FQ-PCR进行叶绿体成熟度与其基因组拷贝数关系的研究。他们以核基因Cab作为内参照，进行叶绿体基因rbc1拷贝数测定，结果发现子叶出现以后，叶绿体基因拷贝数显著增加，进而把叶绿体的基因拷贝
28、数增加与光诱导的叶绿体成熟过程联系起来。1998年美国Higgins等还建立起一套用荧光探针检测鼠疫纤溶酶原激活基因（pla）的实验方法。,综上所述，FQ-PCR作为一种核酸定量技术，应用较多且较成熟的主要是在病原体检测方面，其优越性在此方面也得以充分体现。因此将该项技术进一步开发应用于临床，具有很大潜力。但是在遗传病和肿瘤研究方面，尤其是基因表达的研究，该技术目前应用的还较少，在此方面加强研究应用，将会有广阔的前景。,二、PCR技术应用,研究 基因克隆，DNA测序，分析突变 诊断 细菌、病毒、寄生虫检测，诊断 人类基因组工程 遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱 法医 犯罪现场标本分析 肿瘤 各种肿瘤检测 其他,
