1、,实时荧光定量PCR技术的原理(Real time Quantitative PCR)吴智明,实时荧光定量PCR定义：,在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法。,与普通PCR的区别,普通PCR技术：在PCR结束后对终点产物进行定量分析。实时定量PCR技术： 实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对起 始模板进行定量。,荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般荧光阈值的设置是 基线（背景）荧光信号的标准偏差的 10 倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数被称为 C
2、T 值（ threshold value ）。,荧光定量PCR化学原理,非特异性荧光标记：1、SYBR Green 特异性荧光标记：2、TaqMan,1、SYBR Green 法,SYBR Green 熔解曲线分析,溶解曲线,溶解曲线分析可以用来确定不同的反应产物，包括非特异性产物。扩增反应完成后，通过逐渐增加温度同时监测每一步的荧光信号来产生溶解曲线，随着反应中双链DNA变性，荧光染料又回复到游离状态导致荧光信号降低，用荧光信号改变的负的一次倒数与温度作图，在扩增产物的溶解温度上有一特征峰（Tm，DNA双链解链50的温度），用这个特征峰就可以将特异产物与其它产物如引物二聚体区分开，因为它们在
3、不同的温度溶解.,SYBR Green法优缺点,优点: 对DNA模板没有选择性 适用于任何DNA 使用方便-不必设计复杂探针 非常灵敏 便宜,2、TaqMan探针法,TaqMan作用机理,TaqMan法优缺点,Real-time PCR 临床应用,荧光定量PCR在病原体检测中的应用,一 肝炎病毒定量检测 二 性病病原体检测 三 结核杆菌及呼吸道病原体检测 四 优生优育(TORCH)相关项目检测,临床应用,HBV,（二） HBV-DNA与“两对半”,1. “两对半” ：机体的免疫反应状态；,2. “携带者”、“大三阳”、“小三阳”等免疫学指标不能 反应体内病毒复制水平与感染程度。,FQ-PCR：
4、检测的是HBV本身的遗传物质DNA，是病毒存在和复制的最可靠、最直接的指标。,3. 血清学指标()不能排除HBV感染。,HBV,（二） HBV-DNA与“两对半”,4. 也可能出现HBsAg()，HBV-DNA()。,5. HBsAb () 、 HBcAb () 、 HBeAb ()三抗体阳性 与HBV DNA 2.5 103 copy /ml 结果解释。,(1)HBV基因变异，如S区和前S区的变异，可影响HBsAg的表达或改变其抗原性； (2)HBV-DNA基因重排：HBV-DNA基因整合到宿主染色体中，可导致DNA序列重排，进而影响HBsAg表达。 (3)患者因素：患者处于HBV感染的恢复
5、早期，体内HBsAg水平很低，或患者体内存在长期的低水平HBV复制，采用普通的酶联免疫吸附试验不能检出。 (4)HBsAg免疫复合物的形成：免疫复合物中的抗体封闭复合物内抗原，试剂中抗体不能与复合体内抗原结合，从而致HBsAg假阴性结果。,HBV,(三) HBV-DNA定量检测的临床意义,3. HBV-DNA定量与预后a. 含量高者急性肝炎患者易慢性化 b. 癌变的几率明显高于含量低者,1. HBV-DNA定量与HBV复制水平及传染性,2. HBV-DNA定量与乙肝药物疗效a. 专家提出103 copy /ml做为阴性或临床治愈标准b. HBV-DNA定量分析与干扰素治疗(前、中、后)c. 拉
6、咪呋啶,HBV,(三) HBV-DNA定量检测的临床意义,4. HBV-DNA定量有助于指导怀孕与孕期，哺乳期检查,6. 血液制品和献血员的筛选,二 常见性传播疾病病原体,一 淋球菌（NGH） 二 沙眼衣原体（ CT ） 三 解脲脲原体（UU） 四 梅毒螺旋体（TP） 五 单纯庖疹病毒（HSV） 六 乳头瘤病毒（HPV） 七 人类免疫缺陷病毒（HIV） 八 EV71 A16 通用型,1. 非培养或形态学检查的诊断技术，快速、特异、敏感。 2. 对无症状或症状轻者，可以早期确诊。 3. 对NGH、CT、UU 等混合感染者，诊断和鉴别诊断。 4. 指导用药、考核疗效。,荧光定量PCR诊断NGH/CT/UU的意义,NGH/CT/UU,NGH/CT/UU,荧光定量PCR诊断NGH/CT/UU的意义,5. 不孕不育、优生优育。 6. 流行病学调查，为性传播疾病的监控提供依据。,绝对定量：从荧光到拷贝数,标准品,标准品梯度稀释方法,谢谢！,本文观看结束！,谢 谢 欣 赏！,
