1、分子生物学基础实验分子生物学实验技术已成为生物化学及分子生物学以及相关学科院系教学科研不可缺少的一部分。为提高学生在分子生物学技术方面的动手能力，生物技术综合实验室主要开设常用而基本的分子生物学实验技术。它的内容包括质粒 DNA 的制备；DNA 的重组；PCR 基因扩增等等。 实验一 质粒 DNA 的小量制备一、实验原理要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（vector） 。载体的设计和应用是 DNA 体外重组的重要条件。作为基因工程的载体必须具备下列条件:(1)是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外
2、源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；（3）载体 DNA 链上有 1 到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；（4）载体具有选择性的遗传标记，如有抗四环素基因（Tc r） ，抗新霉素基因（Ne r）等，以此知道它是否已进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。细菌质粒具备上述条件，它是基因工程中常用的载体之一。质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在 1120kb 之间，具有双链闭合环状结构的 DNA 分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能
3、使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control） 。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，它也不复制。每个细胞内只含有 1 个或几个质粒分子。后者的质粒在整个细胞周期中随时复制，在细胞里，它有许多拷贝，一般在 20 个以上。通常大的质粒如 F 因子等，拷贝数较少，复制受到严格控制。小的质粒，如ColE 质粒（含有产生大肠
4、杆菌素 E1 基因） ，拷贝数较多，复制不受严格控制。在使用蛋白质合成抑制剂氯霉素时，染色体 DNA 复制受阻，而松弛型 ColE质粒继续复制 1216h，由原来 20 多个拷贝可扩增至 10003000 个拷贝，此时质粒 DNA 占总 DNA 的含量由原来的 2增加到40 50。质粒 pBR322、pUC19 就是由 ColE 衍生的质粒。所有分离质粒 DNA 的方法都包括三个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒 DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（SDS ）可使细胞壁解，经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌染色体 DNA 缠绕附着在细胞壁碎片
5、上，离心时易被沉淀出来，而质粒 DNA 则留在清液中。用乙醇沉淀、洗涤，可得到质粒 DNA。质粒 DNA 的相对分子量一般在 10610 7 范围内，如质粒 pBR322 的相对分子质量为2.8106，质粒 pUC19 的相对分子质量为 1.7106。在细胞内，共价闭环 DNA（covalently closed circular DNA，简称 cccDNA）常以超螺旋形式存在。如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫做开环 DNA（open circular DNA，简称ocDNA） 。在电泳时，同一质粒如以 cccDNA 形式存在，它比其开环和
6、线状 DNA 的泳动速度快，因此在本实验中，自制质粒 DNA 在电泳凝胶中呈现 3 条区带。二、实验目的1掌握最常用的提取质粒 DNA 的方法和检测方法。2了解制备原理及各种试剂的作用。三、实验材料和试剂材料：大肠杆菌 E.coli，质粒 pegf。试剂：1. LB 培养基：10g/L 胰蛋白胨，5g/L 酵母提取物，10g/L NaCl，用 NaOH 调 pH 至 7.3 左右。如固体培养基则添加 15g/L 琼脂。2. 溶液（pH8.0G.E.T 缓冲液）：50 mmol/L 葡萄糖，25mmol/LTris-HCl，10mmol/L EDTA。灭菌后存放。3. 溶液（0.2mol/LNa
7、OH(内含 1SDS)）：预先配制 1SDS 母液，临用前一天晚上加入0.2mol/LNaOH，4 保存。4. 溶液（pH4.8 乙酸钾溶液）：5mol/L 乙酸钾 60mL、冰乙酸 11.5mL、双蒸馏水 28.5mL。5. 酚/氯仿液 (V/V1/1) ：酚为重蒸酚，配制时，先将氯仿中加入异戊醇，使其体积比为 24:1，然后等量的加入重蒸酚，混匀，并用 0.1mol/LTris-HCl (pH7.6)抽提几次以平衡这一混合物，于棕色瓶中存放，并在上面覆盖等体积的 0.01 mol/LTris-HCl(pH7.6)，4 保存。6. 无水乙醇7. 70乙醇8. pH8.0 TE 缓冲液：10m
8、mol/LTris-HCl、1mmol/LEDTA，其中含 RNA 酶 20g/mL。仪器：恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、台式高速离心机、台式小型振荡器、EP管(1.5mL 微量离心管)、加样器(20uL lmL)、吸头。四、操作步骤（一）培养细菌将带有质粒 pegf 的大肠杆菌接种在含 50g/mL卡那霉素(Ka +)的 LB 液体培养基中，37 振荡培养过夜。注意：添加 Ka+时，须待 LB 培养基冷却到 50左右方可加入。（二）从菌落中快速提取制备质粒 DNA1取 1.5mL(750uL 取两次) 菌液置于 1.5mL Ep 管中， 10000rpm 离心 3min。
9、2弃上清，重复步骤 1，弃上清，加入 150L GET 缓冲液，在涡旋混合器上充分混匀。3加入 300L新配制的 0.2mol/L NaOH(内含 1SDS)，加盖，颠倒（不要振荡）3 次，使之混匀。4加入 225L冰冷的乙酸钾溶液。加盖后，颠倒（不要振荡）3 次使之混匀。510000rpm 离心 5min，上清液吸至另一干净的 1.5mL Ep 中，如上清液浑浊则需重新离心一次。6于上清液中加等体积氯仿，振荡混匀， 10000rpm 离心 5min，小心吸取上清液，转移至另一支1.5mL Ep 管中，注意勿将两液相中间的白色蛋白薄层吸出。7向上清液加入 2 倍体积无水乙醇，混匀，用离心机于
10、10000rpm 离心 5min。小心吸去上清液。8用 0.5mL 70乙醇洗涤沉淀一次，10000rpm 离心 5min，除尽乙醇，室温自然干燥(将离心管倒置于一张纸巾上)，备用。9用 20uL TE 重新溶解 DNA，置于 4保存，供电泳使用。贮存于-20备用，可长期保存。五、思考题1裂解细菌时需注意的事项有哪些？2质粒的基本性质有哪些？3碱裂解法提取质粒 DNA 中各溶液的作用是什么？4抽提质粒 DNA 的方法包括哪几个步骤？5如何提高质粒 DNA 的产量？6为什么质粒 DNA 不能反复在 4、-20 、室温中放置？为达到这一目的，需要注意些什么？实验二 DNA 的含量、纯度与分子量的电
11、泳法测定一、 实验原理测定核酸通常采用两种方法：即紫外分光光度法与琼脂糖凝胶电泳法。1紫外分光光度法DNA 或 RNA 定量时，应在 260nm 和 280nm 两个波长下读数。根据计算在 260nm 波长下，每 1ug/mL DNA 钠盐的 A 值为 0.20，即在 A260=1 时，双链 DNA 含量为 50ug/mL，单链 DNA 与 RNA 含量为 40ug/mL，单链寡核苷酸的含量为 33 ug/mL。双链 DNA 含量A 26050稀释倍数（ug/mL）RNA 含量A 26040稀释倍数（ug/mL）单链 DNA 含量A 26033稀释倍数（ug/mL）此外还可以根据 260nm
12、和 280nm 的读数间的比值（A 260/A280）估计核酸的纯度。2琼脂糖凝胶电泳法根据 DNA 分子量不同，采用外加电场使其分开，用 EB 嵌入 DNA 分子后在紫外下显荧光。而荧光强度正比于 DNA 的含量，如将已知浓度的标准样品表 21 作为电泳对照，就可以估计出待测样品的浓度。电泳后的琼脂凝胶糖直接在紫外灯下拍照，只需要 510ngDNA，就可以从照片上比较鉴别。由于电泳时所用的样品量非常少，只要将浓度控制在几十纳克即可，所以在基因工程中经常被用做检测 DNA 样品。表 21 DNA/ Hind 中 DNA 片断二、实验目的 1从以上实验中提取到的质粒 DNA，为了能作下一步的酶切
13、，连接及转化实验，必须测定 DNA 的纯度、含量以及分子量大小。2本实验旨在学习水平式琼脂糖凝胶电泳，学习检测 DNA、含量与相对分子质量大小。三、实验材料和试剂材料：自制的质粒 DNA、DNA/ Hind 、 。试剂：1标准 DNAmarker(DNA/ Hind )2限制性内切酶 Hind和 10X 缓冲液3酶反应中止液：0.2 5溴酚蓝(含 40蔗糖)，已配好。4溴化乙锭染液（EB）：使用前稀释 1000 倍，母液已配好。注意：EB 是一种诱变剂，配制和使用片段 碱基对数目/kb 相对分子质量 DNA 含量/ % DNA 含量/(ng/mg)1 23.130 15.0106 47.7 4
14、76.92 9.419 6.12106 19.4 194.13 6.557 4.26106 13.5 135.24 4.371 2.84106 9 89.95 2.322 1.51106 4.8 47.96 2.028 1.32106 4.2 41.87 0.564 0.37106 1.1 11.68 0.125 0.08106 0.3 2.6时应戴好手套，并且不能将该染液洒在桌面或地面上！使用后立即用大量的水冲洗干净。50.5TBE 缓冲液：Tris 2.18g、硼酸 1.10g、EDTA-Na 20.14g 用蒸馏水定容至 400mL。可配成 5TBE 母液，使用时稀释 10 倍即可。60
15、.7琼脂糖仪器：37水浴锅、微波炉、稳压电泳仪、凝胶成像系统、电泳槽、Eppendorf 架、恒温摇床、台式小型振荡器、Ep 管(1.5mL)、加样器(20uL lmL)、吸头。四、实验操作（一）质粒 DNA 的酶解1新提的质粒，在 10uL 的体系中用单一酶（如 EcoR）进行处理，即：质粒 DNA 2L10缓冲液 1LEcoR 0.5LddH2O 6.5L237，保温 30min。3加入 1/10 体积的酶反应终止液，混匀以停止酶解反应。各酶解样品于冰箱中贮存备用。（二）琼脂糖凝胶板的制备1琼脂糖凝胶的制备称取 1.0g 琼脂糖，置于锥形瓶中，加入 100mL TBE 缓冲液，瓶口倒扣一小
16、烧杯，于电炉上加热，注意：防止溢出，由于琼脂糖较难溶解，如果水分损失较大，则补充一定量的蒸馏水，使其终浓度为 1。2胶板的制备将有机玻璃内槽洗净、晾干。取胶带纸将有机玻璃内槽的两端边缘封好，形成一个边脚模子。注意：将橡皮膏紧贴在有机玻璃内槽两端边上，不能留空隙。将有机玻璃内槽置于水平位置，放好样品槽模板(一般称之为梳子)，将冷却至 65左右的琼脂糖凝胶，小心地倒在内槽上，控制灌胶速度，使胶液缓慢地展开，直到整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。室温下静置 1h 左右，待凝固完全后，轻轻拔出样品槽模板，撕去胶带纸，胶板上即形成相互隔开的样品槽。将有机玻璃内槽放入电泳槽中，加入 0.5TBE 电泳缓冲
17、液，以盖过胶板为宜。胶板内的样品小槽3加样用微量加样器将上述样品分别加入胶板的样品小槽内，每次加完一个样品为了避免交叉污染，各样品用不同的吸头，以免造成限制酶被污染。加样时，吸头不要插入胶板内，防止碰坏样品槽周围的凝胶面，每个样品槽的加样量不宜过多，本实验加样为 10uL 左右。(每块胶板需点一个 Marker，这里即为 Hind )4电泳加完样品后应立即通电，进行恒压电泳。在低压条件下，线形 DNA 片段的迁移速度与电压成比例关系，为了获得电泳分离 DNA 片段的最大分辨率，电场强度不应高于 5V/cm。当溴酚蓝染料（蓝色）移动到距离胶板下沿约 12cm 处，停止电泳。5染色将电泳后的凝胶浸
18、入 EB 染液中，进行染色以观察在琼脂糖凝胶中的 DNA 带。染色 15min 后，用大量水冲洗。6观察在波长为 254nm 的紫外灯下，观察染色后的电泳凝胶。DNA 存在处显示出红色荧光条带。用凝胶自动成像仪处理代替。五、思考题1简述 EB 显色的原理。2使用溴化乙锭时应注意什么？3说明不同电压对电泳结果的影响是什么4如何判断 DNA 的纯度？实验三 感受态细胞的制备及转化一、实验原理 感受态就是细菌吸收转化因子的生理状态，只有发展为感受态的细胞才能稳定摄取外来的 DNA 分子。转化是将外源 DNA 分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段。转化的基本原理是细胞处于 0，CaCl 2
19、 低渗溶液中，细胞膨胀成球形，转化混合物中的 DNA 形成抗 DNase 的羟基钙磷酸混合物粘附于细胞表面，经 42短时间热冲击处理，促使细胞吸收 DNA 复合物，在选择性培养基平板上培养，可选出所需的转化子。二、实验目的1学习和理解影响细胞感受态的因素，掌握感受态细胞的制备方法。2掌握质粒的转化方法。把体外 DNA 引入受体细胞，使受体菌具有新遗传性，并从中选择出转化子。三、实验材料和用具材料：自制的质粒 DNA、大肠杆菌(E.coli )菌种(DH5 菌株)。试剂：LB 琼脂平板 (无抗生素) 、LB 琼脂平板 (含 50g/L卡那霉素 )、LB 液体培养基 5mL(无抗生素) 、LB 液
20、体培养基 100mL(无抗生素 )、LB 液体培养基 5mL(含 50g/L卡那霉素) 、0.1mol/LCaCl2 溶液(灭菌备用)。仪器：恒温培养箱、恒温摇床、接种环、涂布器、冷冻离心机、离心管、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅。四、操作步骤(一)大肠杆菌感受态细胞的制备1从新活化的 E.coliDH5菌平板上挑取一单菌落，接种于 5mL 液体培养基中，37振荡培养过夜，直至对数生长期。将该菌悬液以 1：50 接种于 50mL LB 液体培养基中，37快速振荡培养34h 。2取 5mL 培养液放入离心管中， 5000rpm 离心 10min。3可用加样器将残余液体尽量去净，用 1mL 预冷的 0
21、.1mol/LCaCl2 溶液轻轻悬浮细胞，冰上放置1530min。4 5000rpm 离心 10min。5弃上清，加入 200L预冷的 0.1mol/LCaCl2 溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻，即制成了感受态细胞悬液。6制好的感受态细胞可在冰上放置，24h 内直接用于转化实验，也可加入占总体积 95左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于 Ep 管中，-70 条件下可保存半年至一年。(二)细胞转化将以上各样品轻轻摇匀，冰上放置 30min 后，于 42水浴中保温 90s，然后迅速在冰上冷却3 5min。上述各管中分别加入 400L LB 液体培养基，使总体积为 500L，该溶液称为转化反应原液
22、，摇匀后于 37振荡培养 4560min，使受体细胞恢复正常生长状态，并使转化体产生抗药性。(三)平板培养取各样品培养液 100L分别接种于含卡那霉素和不含卡那霉素的 LB 平板培养基上(分别记为Ka 和 Ka)，涂匀。37培养 24h，待菌落生长良好且未相互重叠时停止培养。(四)检出转化体五、注意事项1这一个实验中的所有操作均要为无菌操作，在超净工作台内进行。2细胞转化中，42水浴 90s 要准确操作。3制备感受态细胞过程中，需要在冰上放置的一定不要在室温中放置。思考题1感受态细胞制备好后，为什么在转化前还要在冰上放置？2思考转化后平板培养应有的结果、分析自己培养的情况。编号 质粒 感受态细胞 无菌水 0.1mol/LCaCl2样品/uL 2 100 / /对照 1/ uL / 100 2 /对照 2/ uL 2 / / 100不含抗生素培养基 含抗生素培养基 结果分析受体菌对照组 有大量菌落长出 无菌落长出 本实验未产生抗药性菌株质粒对照组 无菌落长出 无菌落长出 质粒 DNA 不含杂菌转化实验组 有大量菌落长出 有菌落长出 质粒进入受体菌中产生抗药性
