分子生物学实验方法-2分子生物学.ppt
- 1.请仔细阅读文档,确保文档完整性,对于不预览、不比对内容而直接下载带来的问题本站不予受理。
- 2.下载的文档,不会出现我们的网址水印。
- 3、该文档所得收入(下载+内容+预览)归上传者、原创作者;如果您是本文档原作者,请点此认领!既往收益都归您。
下载文档到电脑,查找使用更方便
10 文币 0人已下载
下载 | 加入VIP,免费下载 |
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 分子生物学实验方法-2分子生物学.ppt
- 资源描述:
-
1、6 分子生物学研究方法(下) 基因功能研究技术,蛋白质是生命活动的主要执行者蛋白质的功能主要通过与蛋白质以及其他生物分子的相互作用来实现,6.1 蛋白质相互作用技术研究,举世瞩目的基因组计划使大量的新基因不断被发现,然而单纯的基因组DNA序列尚不能解答许多生命问题。基因是相对静态的,而基因编码的产物蛋白质则是动态的,具有时空性和调节性,是生物功能的主要体现者和执行者。蛋白质的表达水平、存在方式以及相互作用等直接与生物功能相关。在所有生命活动中,蛋白质之间的相互作用是必不可少的,它是细胞进行一切代谢活动的基础。细胞接受外源或是内源的信号,通过其特有的信号途径,调节其基因的表达,以保持其生物学特性
2、。在这个过程中,蛋白质占有很重要的地位,它可以调控, 介导细胞的许多生物学活性。,生命的基本过程是不同功能蛋白质在时空上有序和协同作用 新陈代谢以蛋白质复合体或多蛋白质网络协同作用实现 细胞信号转导及病原体感染和免疫反应,因此,揭示蛋白质之间的相互作用关系、建立相互作用关系的网络图,已成为蛋白质组学研究中的热点。研究蛋白质相互作用的方法也就具有更为重要的意义。,免疫共沉淀,荧光共振能量转移技术,噬菌体展示技术,酵母双杂交技术,基因外抑制子,合成致死筛选,分子生物学方法,蛋白质亲和色谱法,遗传学方法,蛋白质相互作用研究方法,生物物理学方法,细菌双杂交技术,蛋白质亲和色谱 protein affi
3、nity chromatography,基本原理是将一种蛋白质固定于某种基质上(如Sepharose离子交换琼脂糖),当细胞抽提液经过该基质时,可与该固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附,而没有被吸附的非目标蛋白则随洗脱液流出。被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或者洗脱条件而回收下来。,洗脱(2),结合(3),检测(6),收集(5),洗脱(4),固定诱 饵蛋白 (1),融合蛋白pull-down实验,为了更有效地利用蛋白质亲和色谱,可以将待纯化的蛋白以融合蛋白形式表达,即将“诱饵”蛋白与一种易于纯化的配体蛋白相融合。1988年Smith等利用谷胱甘肽S转移酶(glutathione-S-transfe
4、rase ,GST)融合标签从细菌中一步纯化出GST融合蛋白。从此GST融合蛋白在蛋白质相互作用研究领域里得到极大的推广。,GST融合蛋白在经过固定有GSH(glutathione)的色谱柱时,就可以通过GST与GSH的相互作用而被吸附。当再有细胞抽提物过柱,就可得到能够与“诱饵”蛋白相互作用的兴趣蛋白。一般来说GST融合蛋白pull-down方法用于两个方面:一是鉴定与已知融合蛋白相互作用的未知蛋白质二是鉴定两个已知蛋白质之间是否存在相互作用,以上两种方法都有共同的缺点:假阳性。实验所检测到的相互作用可能是由蛋白质所带电荷引起的,并不是生理性的相互作用;蛋白的相互作用可能并不是直接的,可能是
展开阅读全文