分子生物学实验指导.doc

1、分子生物学实验指导基础实验实验二十五 核糖核酸的测定【实验目的】1 掌握 RNA 的测定原理2 掌握 RNA 定量技术【实验原理】RNA 分子中的核糖在浓酸中加热，脱水转变成糖醛，后者在氯化铁存在下，与地衣酚试剂（3，5-二羟基甲苯）反应，缩合成绿色化合物，在 670nm 处有最大吸收峰，从而可进行定量测定。待测样品中的 RNA 浓度在 20200g/mL 之间时，其吸光度与浓度成正比。反应式如下：核 糖 糖 醛 绿色化合物【实验内容与方法】1取中试管 3 支，按表 2-17 操作表 2-17 RNA 的测定方法试 剂（mL） 标准管 标本管 空白管RNA 标准液 1.0RNA 提取液 1.0

2、蒸馏水 1.0地衣酚试剂 3.0 3.0 3.02 混匀各管，置于沸水浴中加热 10min，取出冷却，以空白管调零点，在670nm 波长处比色，读取各管的吸光度。3计算肝 组 织标 准标 本 gRNAOD/6.041【实验准备】1 RNA 标准液 准确称取 RNA 用 0.001mol/L NaOH 配制成 100mg/mL 的溶液。2地衣酚试剂 称取地衣酚（3，5-二羟基甲苯）100mg，溶于 100mL 浓盐酸（AR）中，再加入 100mg FeCl3.6H2O。应用前新鲜配制。3仪器：紫外可见分光光度计、试管、刻度吸管（孔峰 张孟业）实验二十六 脱氧核糖核酸提取【实验目的】掌握 DNA

3、分离纯化的原理和方法【实验原理】见 RNA 提取。【实验内容与方法】1肝匀浆制备与 RNA 分离，见 RNA 的提取。2于含有 DNP 的沉淀中加入二倍体积的 1mol/LNaCl 溶液搅拌均匀，室温放置 56h，以充分提取 DNP。3去除蛋白质 将放置完毕的 DNP 混悬液离心 3000rpm/10min，上层转移至另一试管中，加入等体积氯仿-异戊醇混合液，用玻璃纸堵住管口振摇2min，离心 3000rpm/10min，此时管中液体分为三层，下层为氯仿，中层为变性的蛋白质，上层为含有 DNA 的水溶液，将上层转移至另一小试管中（中、下层弃去） ，加二倍体积冰冷的 95%乙醇，边加边摇匀，此时

4、可见有白色纤维状DNA（或为乳白色紊状沉淀） ，离心 3000rpm/5min，弃去上层乙醇溶液，沉淀即为 DNA 的粗制品。【实验准备】11.0mol/L NaCl 溶液2仪器：高速组织捣碎机、离心机、紫外可见分光光度计【注意事项】(1)在制备肝匀浆时，应尽量在冰冷条件下进行，并尽快加入 0.14mol/L氯化钠溶液，以抑制脱氧核糖核酸酶，防止 DNA 的分解以提高核酸得量。(2)各步骤操作应力求准确，尽量减少中途核酸的丢失，保证定量测定的准确性。（孔峰 张孟业）实验二十七 脱氧核糖核酸的测定【实验目的】1掌握 DNA 的比色测定原理2掌握 DNA 定量技术【实验原理】DNA 分子在酸性溶液

5、中加热水解后，其脱氧核糖部分可被浓酸缩水成 -羟基 -酮基戊醛等化合物，再进一步与二苯胺作用，可产生蓝色化合物，在595nm 处有最大吸收峰。从而可进行定量测定。待测样品中的 DNA 浓度在20200g/mL 之间时，其吸光度与浓度成比。反应式如下：脱氧核糖 -羟基- -酮基戊醛【实验内容与方法】1取中试管 3 支，编号，按表 2-18 操作表 2-18 DNA 的测定方法试 剂（mL） 标准管 标本管 空白管DNA 标准液 1.0DNA 提取液 1.0蒸馏水 1.0二苯胺试剂 2.0 2.0 2.02混匀各管，置于沸水浴中加热 10min，取出冷却，以空白管调零点，在 595nm 处比色，读

6、取各管的吸光度。3计算：肝 组 织标 本标 准 gDNAOD/6.014【实验准备】1DNA 标准液 准确称取 DNA 用 0.01mol/L NaOH 配制成 400g/mL 溶液。2二苯胺试剂 称取二苯胺 1.5g（如不纯，须用 70%乙醇重结晶两次） ，溶于 100mL 冰醋酸（AR）中，再加入浓硫酸 1.5mL，贮存在棕色瓶中放入冰箱内保存备用。3仪器：紫外可见分光光度计，试管，刻度吸管。【思考题】1本实验中，测定 RNA 和 DNA 含量的原理是什么？2核酸在细胞质和细胞核中的分布有何特点？（孔峰 张孟业）实验二十八 真核细胞 DNA 的制备与定量【实验目的】掌握真核生物细胞基因组

7、DNA 制备和定量的基本方法。【实验原理】制备基因组 DNA 是进行基因结构和功能研究的重要步骤,通常要求得到的片段长度不小于 100200kb。在 DNA 提取过程中应尽量避免使 DNA 断裂和降解的各种因素,以保证 DNA 的完整性。一般真核细胞基因组 DNA 有 10710 9 bp,可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取。在 EDTA 以及SDS 等试剂存在下用蛋白酶 K 消化细胞,随后用酚抽提而获得 DNA，DNA 经酶切后可用于 Southern 分析,还可用于 PCR 的模板、文库构建等实验。根据材料来源不同,采取不同的材料处理方法,而后的 DNA 提取方法大体类似,

8、但都应考虑以下两个原则:防止和抑制 DNase 对 DNA 的降解;尽量减少对溶液中 DNA 的机械剪切破坏。【实验内容与方法】1细胞处理(1) 收集对数生长期的培养细胞约 5106 于 1.5mL 离心管中，离心1000rpm/5min，弃上清液。(2) 加 0.01mol/L 的 PBS(pH7.2)缓冲液 1mL 重悬细胞，离心1000rpm/5min，弃上清液。(3) 于振荡器上打散细胞，加 500L 裂解缓冲液，充分混匀后置于5055水浴 12h。2DNA 提取(1) 加等体积 Tris 饱和酚至上述样品处理液中, 温和、充分地混匀，4离心 12000rpm/5min。(2) 小心吸

9、取上层水相到另一 1.5mL 离心管中，加等体积酚/ 氯仿，轻轻混匀, 4离心 12000rpm/5min。(3) 取上层水相到另一 1.5mL 离心管中，加等体积氯仿/ 异戊醇，轻轻混匀, 4离心 12000rpm/5min。(4) 转移上层水相到另一 1.5mL 离心管中，加 1/10 体积的 3mol/L 醋酸纳(pH5.2)和 2.5 倍体积的无水乙醇 ,轻轻颠倒混匀。(5) 待絮状物出现后 , 4离心 12000rpm/5min。(6) 弃上清液，沉淀用 75乙醇洗涤，离心 12000rpm/2min。(7) 弃上清液，室温下挥发乙醇,待沉淀将近透明时加 50100l TE 置 4冰

10、箱溶解过夜。3 DNA 定量：DNA 在 260nm 处有最大的吸收峰,蛋白质在 280m 处有最大的吸收峰,盐和小分子则集中在 230m 处。因此，可以在 260nm 波长处测定DNA 吸光度，OD 260 值为 1 时约相当于 50g/ml 的双链 DNA。取 1 l 所得DNA，加 49l 双蒸水，于 260nm 处测定其吸光值。4结果分析：根据 OD260 值可计算出 DNA 样品的浓度 : DNA(mg/ml)=50OD260稀释倍数/1000 。DNA 纯品的 OD260/OD280 为 1.8,故根据OD260/OD280 的值可以估计 DNA 的纯度。若比值较高，说明含有 RN

11、A，比值较低说明有残余蛋白质存在。【实验准备】1.TE 缓冲液 10mmol/L Tris-HCl(pH7.8)、lmmol/L EDTA(pH8.0)2. 0.01mol/L 的 PBS(pH7.2)缓冲液3.裂解缓冲液 10mmol/L Tris-HCl(pH8.0), 15mmol/L NaCl, 10mmol/L EDTA (pH8.0), 1% SDS。使用前加入蛋白酶 K 至 100g/ml。 4. Tris 饱和酚(pH8.0)5. 酚/氯仿(1/1)6. 氯仿/异戊醇（24/1）7. 无水乙醇、75%乙醇【注意事项】1.所有用品均需要高温高压,以灭活残余的 DNA 酶。2.所有

12、试剂均用高压灭菌双蒸水配制。3.用大口滴管或吸头操作,以尽量减少打断 DNA 的可能性。【思考题】1制备真核生物细胞基因组 DNA 时需注意什么？ 2如何检测 DNA？（孔峰 田克立）实验二十九 质粒 DNA 的提取与定量【实验目的】掌握碱裂解法小量制备质粒 DNA 的方法。【实验原理】分离质粒 DNA 的方法是依据其与染色体 DNA 分子大小不同、碱基组成的差异以及质粒 DNA 的超螺旋共价闭环状结构的特点来进行。目前常用的提取质粒的方法有碱裂解法、煮沸法和去污剂法等。本实验采用的是碱裂解法。其原理是将细菌菌膜破裂后，利用质粒 DNA 与染色体 DNA 之间变性与复性的差异而达到分离的目的，

13、因为染色体 DNA 分子量比质粒 DNA 大得多；从细胞中提取到的染色体 DNA 大多断裂成线状分子,而质粒 DNA 则为共价闭合环状结构。在pH 高达 12.6 的条件下，染色体 DNA 的氢键断裂，双螺旋结构解开变性,同时由于受到机械切力或核酸酶等的作用,染色体 DNA 易被切成大小不同的片段；而闭环质粒 DNA 链氢键也断裂，但它的超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，不易发生变性。当以 pH4.8 的醋酸钾高盐缓冲液调节 pH 至中性时，质粒DNA 又恢复其天然构象,以可溶状态存在于液相中，而染色体 DNA 不能复性而形成缠连的不溶性网状结构，与不稳定的大分子 RNA、变性的蛋白

14、质-SDS 复合物以及细菌碎片等一起沉淀而被除去。再进一步用酚、氯仿使蛋白质变性去除蛋白杂质，然后用无水乙醇沉淀质粒 DNA，可得到纯化的质粒 DMA。【实验内容与方法】1操作流程：挑取单菌落接种到含 amp 的 LB 液体培养基管内（3.5ml /管） 放 37培养箱内振荡培养过夜 将菌液倒入 1.5ml 离心管中(尽量倒满) 12000rpm /30s (沉淀菌体) 在原管中重复上述操作 1 次 弃上清扣干,加入预冷的 solution 100L,剧烈振荡打散菌体, 冰浴 5min （以下操作要轻柔）加入新配制的 solution 200L,温和颠倒离心管 23 次混匀，室温放置5min

15、（此时液体应由混浊变为透明粘稠） 加入预冷的 solution 150L, 温和颠倒离心管 23 次混匀，冰浴5min 离心 12000rpm/5min 小心将含有质粒 DNA 的上清移至另一离心管中 加等体积氯仿,轻微振荡，离心 12000rpm /2min 转移上清液至另一离心管 加入 2 倍体积冰冷无水乙醇,轻轻混匀室温放置 2 分钟 离心 12000rpm /5min 弃上清,加入 70%乙醇洗涤沉淀，离心 12000rpm /2min，弃上清重复洗涤 1 次弃上清，液体尽量倒净并在吸水纸上扣干 室温放置 15min 干燥 加入 1TE 30L 溶解质粒,用于定量分析、电泳检测等。【实

16、验准备】 1.氨苄青霉素(amp) 将 amp 配制成 200g/l溶液,分装小管，-20保存。2.LB 液体培养基 取胰蛋白胨 2g, 酵母提取物 1g, 氯化钠 1g, 加水160ml 溶解后用 1mol/L 氢氧化钠调 pH 至 7.0, 定容至 200ml，高压灭菌。临用前加 200g/l 的 amp 60l（每 ml LB 含 amp60g） 。 3. 固体培养基 取胰蛋白胨 2g, 酵母提取物 1g, 氯化钠 1g, 琼脂粉 3g, 加水 160ml 溶解后用 1mol/L 氢氧化钠调 pH 至 7.0, 定容至 200ml，高压灭菌。临用前加 200g/l amp 60l，将固体

17、培养基倒入平皿中, 待凝固后备用。 4. Solution 取蔗糖 17.13g、Tris 3.03g、EDTA 3.72g，加双蒸水定容至 500mL 后 8 磅/英寸 2高压灭菌，或过滤除菌，4贮存。5. Solution 0.2mol/L 氢氧化钠，1%SDS，临用前新鲜配制。注意：SDS易产生气泡，不要剧烈搅拌。6. Solution 5mol/L KAc 60mL,冰醋酸 11.5ml,加双蒸水定容至 100ml,高压灭菌，4贮存。【注意事项】1质粒 DNA 提取过程中动作要轻柔，以免对 DNA 造成损伤；2加入 solution后一定要充分打散菌体；3加入 solution II

18、后放置时间不要超过 5min，以免变性质粒不易复性。4加入 solution II 后液体应由混浊变为透明粘稠，可见拉丝现象。若没有上述现象发生，则实验不能继续下去，应检查试剂配制及操作是否有误，然后重新开始。【思考题】1简述碱裂解法提取质粒的基本原理。2提取质粒 DNA 应注意哪些问题？（孔峰 田克立）实验三十 DNA 琼脂糖凝胶电泳【实验目的】掌握琼脂糖凝胶电泳的原理和基本操作技术。【实验原理】DNA 的电泳原理与蛋白质电泳基本相同。在 pH 高于其 pI 时，DNA 分子带负电荷，在直流电场中 DNA 向正极泳动。不同的 DNA 分子因所带电荷、构象和分子量大小不同，在同一电泳系统中的泳

19、动速度存在差异，因而可以使核酸片段彼此分离，并检测其分子大小。电泳后的凝胶浸泡于荧光染料（如溴化乙锭）中，染料分子可嵌入 DNA 分子碱基之间，在紫外线照射下发出荧光，可观察到核酸片段所在的位置和亮度，从而对 DNA 进行定性或定量测定。琼脂糖凝胶的浓度可根据 DNA 分子的大小来确定，一般基因组 DNA 可用0.8%琼脂糖凝胶进行电泳检测，质粒 DNA 选择 1琼脂糖凝胶，而对只有几百个碱基对的寡核苷酸可制备浓度更高一些的琼脂糖凝胶。【实验内容与方法】1凝胶板的制备 取有机玻璃胶槽，洗净、晾干、安装好（不同型号的电泳槽有不同的安装方法） ，水平放置，注意防止漏胶。将梳子插入到胶槽的定位槽中。

20、2灌胶：将熔化的琼脂糖凝胶冷却至约 65时,小心地将凝胶倒入胶槽上，控制灌胶速度，使胶缓慢地展开，直到整个有机玻璃板表面形成均匀的凝胶层，凝胶厚度一般为 0.30.5cm。3室温下放置约 1h，待胶凝固完全后，将铺胶的有机玻璃胶槽放在电泳槽中，加入 0.5TBE 电泳缓冲液，液面高于凝胶面约 0.5cm ，轻轻拔出梳子。4加样 将实验二十八和实验二十九所得的基因组 DNA 和质粒 DNA 作为上样样品。将样品和上样缓冲液 6：1 混匀，用微量加样器将样品分别加入胶板的样品小槽内（注意：加样时应防止加样器头碰坏凝胶孔壁） 。5电泳 加样完毕后将靠近样品槽一端连接负极，另一端连接正极，接通电源，开

21、始电泳，为防止样品扩散，在样品进胶前可用略高电压。当样品进胶后，应控制电压不高于 5V/cm 。当染料条带移动到距离凝胶前沿 1cm 时，停止电泳。6染色 将电泳后的胶板小心推进含溴化乙锭（0.5g/mL）的染色液中，室温下浸泡约 30min。7观察 小心取出凝胶并用水轻轻冲洗胶表面的溴化乙锭溶液，将凝胶放在紫外灯观察台上，在波长 254nm 紫外灯下进行观察。8结果分析：在 DNA 存在的位置呈现橘红色荧光，肉眼可观察到清晰的条带。基因组 DNA 分子量很大，一般在点样孔附近有单一的高分子量条带。质粒DNA 由于不同构型的 DNA 在琼脂糖凝胶电泳中的迁移率不同，因此在琼脂糖凝胶电泳可出现三

22、条电泳带，分别为三种构型的质粒 DNA，SC 最快, LC 次之,OC最慢。【实验准备】15TBE 取 Tris 5.4g,，硼酸 2.75g，EDTA-Na 2 0.37g，用蒸馏水定容至 1000ml。2称取制备 0.8%和 1.0%凝胶的琼脂糖，加 0.5TBE 微波炉中融化，略冷之后进行灌胶。36上样缓冲液 0.25%溴酚蓝，40%(w/v)蔗糖溶液，贮存于 4。4溴化乙锭 配制成 10mg/ml, 用铝箔或黑纸包裹容器,室温储存。【注意事项】1EB 是强诱变剂并有中等毒性,配制和使用时都应戴手套,并且不要把 EB 洒到桌面或地面上。凡是沾污了 EB 的容器或物品必须经专门处理后才能清

23、洗或丢弃。2当 EB 太浓, 胶染色过深, DNA 带看不清时, 可将胶放入蒸馏水冲泡 30 分钟后再观察。【思考题】1琼脂糖凝胶电泳中 DNA 分子迁移率受哪些因素的影响？2简述 EB 染色的原理及实验注意事项。（孔峰 田克立）实验三十一 DNA 的限制性酶切反应【实验目的】掌握 DNA 限制性内切酶酶切的基本原理。【实验原理】限制性内切酶能特异地识别、结合于一段被称为限制性酶序列的 DNA 序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链 DNA。它可分为三类，其中类限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组 DNA 技术的基本工具酶。绝大多数类限制酶可识别长度为 4 至 6 个核苷酸的回

24、文序列，其切割位点在识别序列中, 有的在对称轴处切割双链 DNA, 产生平末端的 DNA 片段; 有的切割位点在对称轴一侧, 产生带有单链突出末端的 DNA 片段称粘性未端。 【实验内容与方法】1. 用 Hind 酶切： 提取的质粒(pUC18 或 pBR322) 30L 加入 10M Buffer 4L,双蒸水 4L, 加 Hind 2L (12U/L)（终体积为 40L) 37水浴 2h，用电泳检查酶切结果。2用 Pst 酶切 向上述酶切体系中加入 1/10 体积(4L)的 3mol/L NaAC 溶液混匀 加入 2 倍体积的无水乙醇,室温放置 5min离心 12000rpm/5min 去

25、上清,向沉淀(DNA)中加入 70%乙醇洗涤倒净液体,扣干 (注 :如果沉淀被冲开需再离心， 12000rpm，2min，70乙醇洗涤，可重复 23 次) 室温放置 1530min，自然干燥 加 10L 1TE 溶液溶解 DNA 加入 10H buffer 2L, 双蒸水 6L，Pst2L (12U/L) (终体积为 20L) 37水浴 2h，用电泳检查酶切结果3结果分析：酶切样品与 DNA 分子量标准共同进行琼脂糖凝胶电泳，电泳后在相当于质粒 DNA 分子量大小的位置显示肉眼可辨的荧光条带（EB 染色） 。【实验准备】1pUC18(或 pBR322)质粒2Hind 酶及其酶切缓冲液3PstI

26、 酶及其酶切缓冲液【注意事项】(1) 限制性内切酶需保存于-20，操作时应将酶保持在冰浴中，避免长时间置于高温中。(2) 在酶切反应中，应最后加入酶，尽量减少室温接触机会。(3) 加样时吸头垂直进入试剂管，避免碰到管壁，加酶时吸头深入不可过深。每加完一样要换一个吸头，同时在已加的样品前做个记号以防止错加或漏加，避免污染。(4) 注意酶的用量，加入的酶量按 1-3U/ug DNA 计算，酶的体积应低于反应总体积的 10%，以避免酶液中甘油干扰反应。酶量过大时，有产生星号活性的可能，即在识别序列以外的位点进行切割。(5)酶解消化反应温度及时间根据该酶使用说明书而定。【思考题】1酶切时应注意什么？2

27、. 如果一个 DNA 酶解液在电泳后发现 DNA 未被切动,可能是什么原因？（孔峰 田克立）实验三十二 目的 DNA 片段的回收【实验目的】掌握从琼脂糖凝胶中回收纯化 DNA 片段的方法。【实验原理】分离和纯化 DNA 酶切片段是基因工程中常用的手段。在构建重组 DNA 分子时，为了提高重组效率，载体 DNA 和目的基因的酶切片段、包括化学合成的基因、PCR 扩增的产物，以及 DNA 标记反应前后的 DNA 片段等都需要进一步进行分离纯化与回收。另外在检测重组 DNA 的分子杂交技术中，要制备 DNA 探针，往往也要先分离回收以获得纯度较高的 DNA 片段。目前用于回收 DNA 片段的方法很多

28、，可以根据待回收 DNA 片段的纯度、大小、浓度和实验室现有的条件等选择合适的方法。【实验内容与方法】1. 酶切之后进行琼脂糖凝胶电泳,电泳结束后在长波紫外灯下切出含有目的 DNA 片段的凝胶,注意去除多余凝胶，尽量减少胶体积（切胶时注意不要将DNA 长时间暴露于紫外灯下，以防止 DNA 损伤） 。2称量胶块重量，计算胶块体积：1mg=1l。3将胶块尽量切碎，以提高 DNA 的回收率。4向胶块中加入 3 倍凝胶体积量的胶块融化液 DR-I buffer。5. 置 75水浴中加热融化胶块，期间间断振荡混合，使胶块充分融化（约 610min） 。6. 向上述胶块融化液中加入 DR-I buffer

29、 量的 1/2 的 DR-II buffer，混合均匀。 7. 将 Spin Column 管安放于 Collection 管上。8. 将操作 6 中的溶液转移至 Spin Column 中，离心 3600rpm/1min,弃滤液。（可将滤液再加入 Spin Column 中离心一次，可提高 DNA 的回收率）9将 500l 的 RiuseA 液加入 Spin Column 中，离心 3600rpm/30s, 弃滤液。10. 将 700l 的 RiuseB 液加入 Spin Column 中，离心 3600rpm,30s, 弃滤液。11重复步骤 10，然后再离心 12000rpm/1min.1

30、2将 Spin Column 放置于一只新的 1.5ml 离心管上，在 Spin Column 膜中央出加入 25l 水或 TE，室温静置 1min。13离心 12000rpm，1min，洗脱回收 DNA。14结果分析：回收纯化的 DNA 经琼脂糖凝胶电泳检测可见特定分子量大小的单一的清晰条带。【实验准备】11琼脂糖凝胶2待纯化的 DNA3琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒4去离子水或 TE（pH7.6）【注意事项】紫外光对 DNA 分子有切割作用，从胶上回收 DNA 时,应尽量缩短光照时间并采用长波长紫外灯(300-360nm), 以减少紫外光对 DNA 的损伤。【思考题】 从凝胶中回收 DNA

31、，切胶时需注意什么？(孔峰 田克立)实验三十三 大肠杆菌感受态细胞的制备【实验目的】掌握制备大肠杆菌感受态细胞的方法。【实验原理】体外连接的重组 DNA 分子导入合适的宿主细胞中才能大量的进行复制、增殖和表达。细菌处于容易吸收外源 DNA 的状态叫感受态。CaCl2法是目前实验室常用的制备感受态细胞的方法，其原理是使细菌处于0、CaCl 2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，细胞膜的通透性发生改变，外源DNA 附着于细胞膜表面，经 42短时间热冲击处理，促进细胞吸收 DNA 复合物。本实验以 JM109 菌珠为受体细胞，用 CaCl2处理受体菌使其处于感受态。转化是指质粒 DNA 或以它为载体构建的重

32、组子导入细菌的过程。利用pBR322(或 pUC18)质粒转化制备的感受态菌，可用于所制备感受态菌的转化鉴定。pBR322 质粒携带有氨苄青霉素和四环素的抗性基因，可使接受了该质粒的受体菌具有了氨苄青霉素和四环素抗性，将经过转化后的受体细胞经过适当稀释，在含氨苄青霉素和四环素的平板培养基上培养，只有转化子才能存活，而未受转化的受体细胞则因无抵抗氨苄青霉素和四环素的能力而死亡。【实验内容与方法】1感受态细胞的制备（1） 从新活化的 JM109 菌平板上挑取单菌落，接种于 5ml LB 液体培养基中（不含 Amp） ，37振荡培养 12h 左右，至对数生长期，将该菌液以1:1001:50 转接于

33、100ml LB 培养基中，37振荡培养 23h（OD 600约0.20.4） 。（2） 将菌液冰浴 10min 后，转入离心管中，于 4离心4000rpm，10min，去上清，收集菌体。 （3）. 用 10ml 冰预冷的 0.1mol/L CaCl2悬浮细胞，冰浴 1530min。（4） 04，离心 4000rpm，10min。（5） 弃上清液，每 50ml 初始培养物加入 2ml 冰预冷的 0.1mol/L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置 30min。（6） 制备好的感受态细胞悬浮液可在冰上放置 24h 内直接用于转化实验，也可加入 1/10 高压灭菌甘油, 置-70冻存。2感受态

34、(JM109)转化鉴定(无菌操作) 1 取感受态细菌 100l，加入 pUC18（或 pBR322）质粒(0.3mg/ml)10ul混匀。2 冰浴 30min 后,42水浴热休克 2min，再于冰浴 2min,加入 LB 液体培养基 0.5ml, 37振荡培养 40min。3分别取菌液 30100ul 加到含 Amp 的 LB 固体培养基平皿上， 用三角玻璃刮刀铺板室温放置 2min，然后倒置放入 37恒温培养箱培养过夜,观察是否有菌落。4结果分析：在培养基平板上应可以观察到转化子形成的菌落。【实验准备】1LB 培养基 取胰蛋白胨 2g, 酵母提取物 1g, 氯化钠 1g, 加水 160mL

35、溶解后用 1mol/L 氢氧化钠调 pH 至 7.0, 定容至 200mL，高压灭菌。2固体培养基 取胰蛋白胨 2g, 酵母提取物 1g, 氯化钠 1g, 琼脂粉 3g, 加水 160mL 溶解后用 1mol/L 氢氧化钠调 pH 至 7.0, 定容至 200mL，高压灭菌。临用前将固体培养基融化后倒入平皿中, 待凝固后备用。30.1mol/L CaCl2 取 CaCl2 1.11 克加双蒸水定溶至 100mL，然后用 0.22m微孔滤膜过滤除菌。【注意事项】1. 实验中所用的器皿均要灭菌，以防止杂菌和外源 DNA 的污染。2. 实验过程中要注意无菌操作，溶液移取、分装等均应在无菌超净工作台上

36、进行。3. 应收获对数生长期的细胞用于制备感受态，OD 600不应高于 0.6。4. 制备感受态细胞所用试剂如 CaCl2等的质量要好。 5. 整个实验一定要在冰浴条件下操作，温度时高时低会影响转化效率。642热处理很关键，温度要准确，转移速度要快。【思考题】1 何谓感受态细胞？2制备感受态细胞时需注意什么？(孔峰 田克立)实验三十四 DNA 的连接转化及阳性克隆的筛选【实验目的】学习 DNA 体外重组技术及转化方法了解蓝白斑实验筛选转化子的原理和方法。【实验原理】外源 DNA 与载体分子的连接就是 DNA 重组，这种重新组合的 DNA 叫做重组子。DNA 在体外的连接重组是基因工程操作的核心

37、技术之一，其本质是一个酶促反应过程。即在一定的条件下，DNA 连接酶催化两个双链 DNA 片段的 5端磷酸和 3端羟基之间相互作用，形成磷酸二酯键的过程。常用的 DNA 连接酶有两种：T4 噬菌体 DNA 连接酶和大肠杆菌 DNA 连接酶。其中 T4 噬菌体 DNA 连接酶对底物的要求低，能更有效地连接 DNA 的平末端，应用更广泛。T4 噬菌体 DNA连接酶需要镁离子和 ATP 作为辅助因子，在一定的温度和 pH 条件下进行连接反应。体外连接的重组 DNA 分子必须导入合适的宿主细胞中才能大量的进行复制、增殖和表达。本实验利用 pUC18 作为载体，经 T4 DNA 连接酶作用，将外源基因插

38、入其多克隆位点，构建重组质粒，转化到大肠杆菌 JM109 感受态细胞中，利用蓝白斑实验筛选出转化子。【实验内容与方法】1取目的基因 2l+载体 2l（均经 Hind III 和 Pst I 双酶切） 2. 加入 10Ligation buffer 1l, T4 连接酶 1l 3. 加双蒸水 4l (终体积 10l), 16下过夜（12h16h） 。 4. 取已制备的感受态细菌 100l,加入 10l 连接后的重组 DNA 溶液混匀，冰浴 30min。 5. 42水浴 2min，再于冰浴 2min, 加入 0.5ml LB 液体培养基(不含 amp),37振荡培养 40 分钟。 6. 取含 am

39、p 的 LB 固体培养平皿一个,加入 X-gal 10l, 涂均匀。7. 取上述菌液加入 IPTG 4l 混匀铺上平皿, 涂匀。 8. 放入 37恒温培养箱中培养 24h, 观察结果。9结果分析：培养皿上可见到蓝色和白色的菌落，白色菌落为含有重组质粒的阳性克隆。【实验准备】1载体 DNA，外源 DNA2T4 DNA 连接酶310T4 DNA 连接酶缓冲液4感受态细菌5LB 液体培养基6LB 固体培养基平皿（含 amp）7X-gal8IPTG【注意事项】1根据具体情况调节酶的用量。平端连接效率比粘端连接低得多，因而应加大酶的用量。2正确调整载体 DNA 和外源 DNA 之间的比例有助于获得高产量

40、的重组产物。一般外源 DNA 的摩尔数应控制在载体 DNA 摩尔数的 310 倍。融合实验指导（选编）实验二 总 RNA 的提取及 RT-PCR 扩增目的基因【实验目的】1掌握真核生物细胞基因组 RNA 制备和定量的基本方法。2掌握反转录 PCR 的原理及实验方法。3掌握 PCR 技术原理和基本实验步骤。【实验原理】获得高纯度和完整的 RNA 是很多分子生物学实验所必需的，如 Northern杂交、cDNA 合成及体外翻译等实验。由于细胞内大部分 RNA 是以核蛋白复合体的形式存在，所以在提取 RNA 时要利用高浓度的蛋白质变性剂，迅速破坏细胞结构，使核蛋白与 RNA 分离，释放出 RNA。再

41、通过酚、氯仿等有机溶剂处理、离心，使 RNA 与其他细胞组分分离，得到纯化的总 RNA。通常一个典型的哺乳动物细胞约含 10-5g RNA，其中大部分为 rRNA 及tRNA，而 mRNA 仅占 1%5%。在基因表达过程中，mRNA 作为蛋白质翻译合成的模板，编码了细胞内所有的多肽和蛋白质，因此 mRNA 是分子生物学的主要研究对象之一。mRNA 分子种类繁多，分子大小不均一，但在多数真核细胞 mRNA 的 3末端都带有一段较长的多聚腺苷酸链（polyA） ，可以从总 RNA中用寡聚(dT)亲和层析等方法分离出 mRNA。聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR

42、)是利用两已知序列的寡核苷酸作为上、下游引物,在耐热性 DNA 聚合酶(Taq 酶)作用下将位于模板 DNA 上两引物间特定 DNA 片段进行一种指数级增长的复制过程。PCR 反应体系由模板 DNA、引物、耐热性 DNA 聚合酶、底物(四种 dNTP)、缓冲液和 Mg2+等组成。其操作过程为变性、退火、延伸等三个步骤循环进行。其中变性是加热条件下模板 DNA 双链间的解离,退火是降低温度使模板 DNA 与高浓度引物间的互补结合,延伸是在耐热性 DNA 聚合酶和 Mg2+等存在下扩增特定的 DNA 片段。每次循环扩增产物又可作为下一循环的模板,因此理论上每经过一轮变性、退火、延伸三个步骤,特定

43、DNA 片段的分子数目增加一倍。耐热性 DNA 聚合酶的应用使 PCR 循环反应可自动进行 ,提高了反应的特异性和效率。引物设计是 PCR 技术的关键步骤，直接影响扩增的效率和特异性。同时，通过适当改变引物的设计可实现多种 PCR 技术，现在利用计算机软件可辅助设计某一己知序列基因的特定引物。PCR 是一种体外大量扩增特异 DNA 片段的分子生物学技术,具有省时、操作简便、特异性强、灵敏度高、效率高、应用范围广等特点。PCR 技术在医学、分子生物学领域得到广泛应用，如应用于 DNA 克隆、突变分析、基因融合、基因半定量、遗传性疾病的诊断等方面。PCR 技术还可与其它分子生物学技术相结合发展产生

44、新的技术，如反转录 PCR(RT-PCR)、反向 PCR(IPCR)、不对称PCR 等,使 PCR 在科研及临床上的应用得到更大发展。反转录（reverse transcription）也称为逆转录，是依赖 RNA 的 DNA 合成作用，以 RNA 为模版，由 dNTP 聚合成 DNA 分子。反应过程先以单链 RNA 的基因组为模板，催化合成一条单链 DNA。产物与模板生成 RNA:DNA 杂化双链，杂化双链中的 RNA 被 RNA 酶水解后，再以新合成的单链 DNA 为模板，催化合成第二链的 DNA。催化此反应的酶称为逆转录酶，也称反转录酶。反转录-聚合酶链反应 (Reverse Trans

45、cription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)是 PCR 技术的一种广泛应用的形式，原理是：提取组织或细胞中的总 RNA，以其中的 mRNA 作为模板，采用 Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成 cDNA。再以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR 使 RNA 检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA 样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成 cDNA 探针、构建 RNA 高效转录系统。本实验通过提取培养细胞的总 RNA，以反转录酶进行反转录反应获得cDNA，作

46、为 PCR 的模板扩增人 3-磷酸甘油醛脱氢酶 (GAPDH)基因中一段300bp 的 DNA 片段，两个引物的 5末端分别引入 EcoR I 和 BamH I 的酶切位点，为 DNA 重组实验做准备。【实验内容与方法】1真核细胞总 RNA 的提取与鉴定(1) 培养细胞 收集细胞 1107210 7 于 1.5ml 离心管中, 加入 Trizol 1ml，混匀，室温静置 5min。(2) 组织 取 12g 组织(新鲜或-70及液氮中保存的组织均可 )置组织匀浆器中,加入 Trizol 1ml，混匀，室温静置 5min。(3) 加 0.2ml 氯仿, 振荡 15s, 静置 2min。(4) 4离

47、心 12000rpm/15min。(5) 小心吸取上层含有 RNA 的水相,并转移至一新的 1.5ml 离心管中。避免吸取两相之间的蛋白物质。(6) 加 0.6 倍体积的异丙醇, 轻轻颠倒混匀，室温放置 10min。(7) 4离心 ,12000rpm/10min。(8) 弃上清, 加入 70%乙醇 1ml 洗涤 RNA 沉淀。4离心, 12000rpm/5min。(9) 弃上清, 将沉淀晾干。 (10) 加入适量 DEPC 水溶液溶解 RNA (65促溶 1015min)。(11) 总 RNA 定量：RNA 定量方法与 DNA 定量相似，RNA 在 260nm 波长处有最大的吸收峰。OD 26

48、0 值为 1 时约相当于 40g/mL 单链 RNA。(12) 结果分析：根据 OD260 可计算 RNA 样品浓度: RNA (mg/mL) = 40OD260稀释倍数/1000。RNA 纯品的 OD260/OD280 的比值为 2.0，故根据OD260/OD280 的比值可以估计 RNA 的纯度。若比值较低，说明有残余蛋白质存在；比值太高，则提示 RNA 有降解。2反转录反应（1） 在 0.5ml 微量离心管中，加入提取的总 RNA 1-5g，补充适量的DEPC H2O 使总体积达 11l。在管中加 10M Oligo（dT）1ul 或 random hexamer primer（随机引物）1ul，轻轻混匀、离心。（2） 70加热 5min，立即将微量离心管插入冰上。然后加入下列试剂的混合物：5PCR buffer 4 l Ribonuclease