1、分子生物学基本技术- -第一章 质粒 DNA 的分离、纯化和鉴定第一节 概 述把一个有用的目的 DNA 片段通过重组 DNA 技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。细菌质粒是重组 DNA技术中常用的载体。质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从 1-200kb 不等,为双链、闭环的 DNA 分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中,它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质,如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可
2、以正常存活。质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗性等。F 质粒(又称 F 因子或性质粒) 、R 质粒(抗药性因子)和Col 质粒 (产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。 质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型(Stringent control)和松驰控制型(Relaxed control)。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时,它也不能复制,通常每个细胞内只含有 1 个或几个质粒分子,如 F 因子。后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有许多拷贝,一般在 20 个以上,如 Col E1 质粒。在使用蛋白质合成抑制剂- 氯霉素时,细胞内蛋白
3、质合成、染色体 DNA 复制和细胞分裂均受到抑制,紧密型质粒复制停止,而松驰型质粒继续复制,质粒拷贝数可由原来 20 多个扩增至1000-3000 个,此时质粒 DNA 占总 DNA 的含量可由原来的 2%增加至 40-50%。利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在,当两种质粒同时导入同一细胞时,它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争,在一些细胞中,一种质粒占优势,而在另一些细胞中另一种质粒却占上风。当细胞生长几代后,占少数的质粒将会丢失,因而在细胞后代中只有两种质粒的一种,这种现象称质粒的不相容性(Incompatibility)。但利用不同复制系统的质粒则可以稳定地共
4、存于同一宿主细胞中。质粒通常含有编码某些酶的基因,其表型包括对抗生素的抗性,产生某些抗生素,降解复杂有机物,产生大肠杆菌素和肠毒素及某些限制性内切酶与修饰酶等。质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。与天然质粒相比,质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列 ,并去掉了大部分非必需序列,使分子量尽可能减少,以便于基因工程操作。大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列,这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链 DNA、体外转录外源 DNA 序列、鉴定片段的插入方向、外
5、源基因的大量表达等。一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性：（1）分子量小、多拷贝、松驰控制型；（2）具有多种常用的限制性内切酶的单切点；（3）能插入较大的外源 DNA 片段；（4）具有容易操作的检测表型。常用的质粒载体大小一般在 1kb 至 10kb 之间,如 PBR322、PUC 系列、PGEM 系列和 pBluescript（简称 pBS）等。从细菌中分离质粒 DNA 的方法都包括 3 个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞 ;分离和纯化质粒 DNA。采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁,十二烷基磺酸钠(SDS)和 Triton X-100 可使细胞膜裂解。经溶菌酶和 SDS 或 Tri
6、ton X-100 处理后,细菌染色体 DNA 会缠绕附着在细胞碎片上,同时由于细菌染色体 DNA 比质粒大得多,易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。当用强热或酸、碱处理时,细菌的线性染色体 DNA 变性,而共价闭合环状 DNA(Covalently closed circular DNA,简称 cccDNA)的两条链不会相互分开,当外界条件恢复正常时,线状染色体 DNA 片段难以复性,而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起,而质粒 DNA 双链又恢复原状,重新形成天然的超螺旋分子,并以溶解状态存在于液相中。在细菌细胞内,共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中,除了
7、超螺旋 DNA 外,还会产生其它形式的质粒 DNA。如果质粒 DNA 两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消除链的张力,形成松驰型的环状分子,称开环 DNA(Open circular DNA, 简称 ocDNA)；如果质粒 DNA 的两条链在同一处断裂,则形成线状 DNA(Linear DNA)。当提取的质粒 DNA 电泳时,同一质粒 DNA 其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。第二节 材料、设备及试剂一、材料含 pBS 的 E. coli DH5 或 JM 系列菌株 ,1.5ml 塑料离心管(又称 eppendorf 管),离心管架。二、设备微量取液器(20
8、l,200l,1000l), 台式高速离心机,恒温振荡摇床, 高压蒸汽消毒器(灭菌锅), 涡旋振荡器, 电泳仪,琼脂糖平板电泳装置和 恒温水浴锅等。三、试剂 1. LB 液体培养基(Luria-Bertani) ：称取蛋白胨(Tryptone)10 g,酵母提取物(Yeast extract) 5 g,NaCl 10 g,溶于 800ml 去离子水中,用 NaOH 调 pH 至 7.5, 加去离子水至总体积 1 升,高压下蒸气灭菌 20 分钟。 2. LB 固体培养基：液体培养基中每升加 12g 琼脂粉,高压灭菌。 3. 氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)母液：配成 50mg/ml
9、水溶液, -20保存备用。 4. 溶菌酶溶液： 用 10mmol/L TrisCl(pH8.0)溶液配制成 10mg/ml,并分装成小份( 如 1.5ml)保存于-20,每一小份一经使用后便予丢弃。 5. 3mol/l NaAc (pH5.2)： 50ml 水中溶解 40.81g NaAc3H2 O,用冰醋酸调 pH 至 5.2, 加水定容至 100ml, 分装后高压灭菌,储存于 4冰箱。 6. 溶液：50 mmol/L 葡萄糖,25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0), 10mmol/L EDTA (pH8.0)。 溶液可成批配制,每瓶 100ml,高压灭菌 15 分钟,储存于 4
10、冰箱。 7. 溶液：0.2 mol/L NaOH (临用前用 10mol/L NaOH 母液稀释 ),1 SDS。 8. 溶液：5 mol/L KAc 60ml,冰醋酸 11.5ml, H2O 28.5ml,定容至 100ml, 并高压灭菌。溶液终浓度为: K+ 3mol/L, Ac 5mol/L。 9. RNA 酶 A 母液：将 RNA 酶 A 溶于 10mmol/L TrisCl(pH7.5), 15mmol/L NaCl 中,配成 10mg/ml 的溶液,于 100加热 15 分钟,使混有的 DNA 酶失活。冷却后用 1.5ml eppendorf 管分装成小份保存于 -20。 10.
11、饱和酚：市售酚中含有醌等氧化物,这些产物可引起磷酸二酯键的断裂及导致 RNA 和 DNA 的交联,应在 160用冷凝管进行重蒸。重蒸酚加入 0.1的 8-羟基喹啉(作为抗氧化剂),并用等体积的 0.5mol/L TrisCl (pH8.0)和 0.1mol/L TrisCl(pH8.0)缓冲液反复抽提使之饱和并使其 pH 值达到 7.6 以上,因为酸性条件下 DNA 会分配于有机相。 11. 氯仿:按氯仿:异戊醇24:1 体积比加入异戊醇。氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开,异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。按体积/体积1:1 混合上述饱和酚与氯仿即得酚/氯仿(1:1)。酚和氯仿均
12、有很强的腐蚀性,操作时应戴手套。 12. TE 缓冲液：10 mmo/L TrisCl (pH8.0),1 mmol/L EDTA (pH8.0)。高压灭菌后储存于 4冰箱中。 13. STET：0.1 mol/L NaCl,10mmol/L TrisCl(pH8.0),10 mmol/L EDTA (pH8.0), 5% Triton X-100。 14. STE：0.1mol/L NaCl,10mmol/L TrisCl(pH8.0),1mmol/L EDTA (pH8.0)。 15. 电泳所用试剂： （1） TBE 缓冲液 (5)：称取 Tris 54g,硼酸 27.5g,并加入 0.5
13、M EDTA (pH8.0) 20ml,定溶至 1000ml。 （2）上样缓冲液 (6)：0.25% 溴酚蓝 ,40% (w/v) 蔗糖水溶液。 第三节 操作步骤一、 细菌的培养和收集将含有质粒 pBS 的 DH5 菌种接种在 LB 固体培养基(含 50g/ml Amp)中, 37培养 12-24 小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB 液体培养基 (含 50g/ml Amp)中,37振荡培养约 12 小时至对数生长后期。 二、 质粒 DNA 少量快速提取 质粒 DNA 小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒 DNA 十分有用。这些方法共同特点是简便、快速,能同时处理大量试样
14、,所得 DNA 有一定纯度,可满足限制酶切割、电泳分析的需要。（一）、煮沸法 1. 将 1.5ml 培养液倒入 eppendorf 管中,4下 12000离心 30 秒。 2. 弃上清,将管倒置于卫生纸上几分钟,使液体流尽。 3. 将菌体沉淀悬浮于 120ml STET 溶液中, 涡旋混匀。 4. 加入 10ml 新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡 3 秒钟。 5. 将 eppendorf 管放入沸水浴中,50 秒后立即取出。 6. 用微量离心机 4下 12000g 离心 10 分钟。 7. 用无菌牙签从 eppendorf 管中去除细菌碎片。 8. 取 20ml 进行电泳检查。
15、 注意1. 对大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌落直接进行煮沸法提取质粒 DNA。 2. 煮沸法中添加溶菌酶有一定限度,浓度高时,细菌裂解效果反而不好。有时不同溶菌酶也能溶菌。 3. 提取的质粒 DNA 中会含有 RNA,但 RNA 并不干扰进一步实验,如限制性内切酶消化 ,亚克隆及连接反应等。（二）、 碱法1. 取 1.5ml 培养液倒入 1.5ml eppendorf 管中,4下 12000g 离心 30 秒。 2. 弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。 3. 菌体沉淀重悬浮于 100l 溶液中( 需剧烈振荡),室温下放置 5-10 分钟。 4. 加入新配制的溶液200l, 盖紧
16、管口,快速温和颠倒 eppendorf 管数次,以混匀内容物( 千万不要振荡), 冰浴 5 分钟。 5. 加入 150l 预冷的溶液 ,盖紧管口,并倒置离心管,温和振荡 10 秒,使沉淀混匀,冰浴中 5-10 分钟,4 下 12000g 离心 5-10 分钟。 6. 上清液移入干净 eppendorf 管中 ,加入等体积的酚/氯仿(1:1), 振荡混匀,4下 12000g 离心 5 分钟。 7. 将水相移入干净 eppendorf 管中 ,加入 2 倍体积的无水乙醇,振荡混匀后置于 -20冰箱中 20 分钟,然后 4下 12000g 离心 10 分钟。 8. 弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使
17、所有液体流出,加入 1ml 70乙醇洗沉淀一次,4 下 12000g 离心 5-10 分钟。 9. 吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,真空干燥 10 分钟或室温干燥。 10. 将沉淀溶于 20l TE 缓冲液(pH8.0, 含 20g /ml RNaseA)中,储于-20冰箱中。注意 1. 提取过程应尽量保持低温。 2. 提取质粒 DNA 过程中除去蛋白很重要 ,采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好,要将蛋白尽量除干净需多次抽提。 3. 沉淀 DNA 通常使用冰乙醇,在低温条件下放置时间稍长可使 DNA 沉淀完全。沉淀 DNA 也可用异丙醇(一般使用等体积), 且沉淀完全,速度快
18、,但常把盐沉淀下来,所以多数还是用乙醇。 （三）、Wizard 少量 DNA 纯化系统Promega 公司的 Wizard 少量 DNA 纯化系统可快速有效的抽提质粒 DNA,整个过程只需 15 分钟。提取的质粒可直接用于 DNA 测序、酶切分析和体外转录等。 该系统中所含试剂和柱子可以用于 50 次 1-3ml 质粒培养液的分离和纯化,试剂包括 10ml 细胞悬浮液,10ml 细胞裂解液；10ml 中和液,50ml Wizard 少量 DNA 纯化树脂,50ml 柱洗液（使用前加 95%乙醇至 120ml )和 50 支 Wizard 微型柱。 1. 1-3ml 过夜培养细胞液 4下 120
19、00g 离心 1-2 分钟。 2. 去除上清液,菌体细胞悬浮于 200l 细胞悬浮液中,充分混合,并移入 eppendorf 管中。 3. 加 200l 细胞裂解液 , 颠倒离心管数次,直到溶液变清亮。 4. 加 200l 中和液 ,颠倒离心管数次。 5. 4下 12000g 离心 5 分钟,取上清液于新的 eppendorf 管中。 6. 加 1ml Wizard 少量 DNA 纯化树脂,颠倒离心管数次以充分混匀。 7. 取一次性注射器, 取出注塞,并使注射筒与 Wizard 微型柱连接,用移液枪将上述混合液加入注射筒中,并用注塞轻推,使混合物进入微型柱。 8. 将注射器与微型柱分开,取出注
20、塞, 再将注射筒与微型柱相连,加入 2ml 柱洗液,并用注塞轻推,使柱洗液进入微型柱。 9. 取出微型柱置于 eppendorf 管中 ,离心 2 分钟以除去微型柱中的柱洗液。 10. 将微型柱放在一个新 eppendorf 管中,加 50l TE(或水)于微型柱中,静止 1 分钟后,4下 12000g 离心 20 秒。 11. 丢弃微型柱,将 eppendorf 管中的质粒 DNA 贮于 4或-20冰箱。 注意 树脂使用前应充分混匀,如有结晶,可将树脂用 25-37水浴处理 10 分钟。三、质粒 DNA 的大量提取和纯化在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒 DNA,
21、为此需要大量提取质粒 DNA。大量提取的质粒 DNA一般需进一步纯化,常用柱层析法和氯化绝梯度离心法。 （一）、碱法1. 取培养至对数生长后期的含 pBS 质粒的细菌培养液 250ml,4下 5000g 离心 15 分钟,弃上清,将离心管倒置使上清液全部流尽。 2. 将细菌沉淀重新悬浮于 50ml 用冰预冷的 STE 中（此步可省略）。 3. 同步骤 1 方法离心以收集细菌细胞。 4. 将细菌沉淀物重新悬浮于 5ml 溶液 I 中,充分悬浮菌体细胞。 5. 加入 12ml 新配制的溶液 II, 盖紧瓶盖,缓缓地颠倒离心管数次,以充分混匀内容物,冰浴 10 分钟。 6. 加 9ml 用冰预冷的溶
22、液 III, 摇动离心管数次以混匀内容物,冰上放置 15 分钟,此时应形成白色絮状沉淀。 7. 4下 5000g 离心 15 分钟。 8. 取上清液,加入 50ml RNA 酶 A(10mg/ml), 37水浴 20 分钟。 9. 加入等体积的饱和酚/氯仿,振荡混匀,4下 12000g 离心 10 分钟。 10. 取上层水相, 加入等体积氯仿,振荡混匀,4下 12000g 离心 10 分钟。 11. 取上层水相,加入 1/5 体积的 4mol/L NaCl 和 10% PEG(分子量 6000), 冰上放置 60 分钟。 12. 4下 12000g 离心 15 分钟, 沉淀用数 ml 70%冰
23、冷乙醇洗涤,4下 12000g 离心 5 分钟。 13. 真空抽干沉淀,溶于 500ml TE 或水中。 注意 1. 提取过程中应尽量保持低温。 2. 加入溶液 II 和溶液 III 后操作应混和 ,切忌剧烈振荡。 3. 由于 RNA 酶 A 中常存在有 DNA 酶,利用 RNA 酶耐热的特性,使用时应先对该酶液进行热处理(80 1 小时),使 DNA 酶失活。 （二）、Wazard 大量 DNA 纯化系统 碱法大量提取 DNA 往往需要很长的时间.Promega 公司的 Wiazrd 大量 DNA 纯化系统既简单又快速,只需要离心和真空抽干,这个系统可以从 500ml 培养液中在 3 小时以
24、内获得 1mg 以上的高质量的质粒 DNA(200-20000bp)。该系统不需要酚和氯仿抽提,纯化后的 DNA 溶于水或 TE 缓冲液中,不含任何盐份,可以直接用于 DNA 序列分析和酶切反应,也可以用于在核酸酶抑制剂（如 RNasin）存在的条件下进行体外转录反应等。 该系统中含有的试剂和柱子可以用于 10 次 100-500ml 质粒培养液的分离和纯化,试剂包括: 150ml 细胞悬浮液,150ml 细胞裂解液,150ml 中和液,100ml Wizard 大量 DNA 纯化树脂,125ml Wizard 柱子洗脱溶液和 10 支 Wizard 带有存储离心管的柱子。 1. 100-50
25、0ml 细胞培养液置离心管中 , 22-25下 5000g 离心 10 分钟 , 所得细胞沉淀充分悬浮于细胞悬浮液中。 2. 加 15ml 细胞裂解溶液并轻轻混合,可以反复倒置混合,但不能用涡旋振荡,细胞裂解完全时,溶液会变清,这一步需要 20 分钟。 3. 加 15ml 中和溶液 ,立即反复倒置离心管数次,并使之混匀。 4. 14000g,22-25离心 15 分钟。 5. 小心地将上清液吸出并移至一个新离心管中。 6. 加 0.5 倍体积的异丙醇,混合均匀, 14000g 22-25下离心 15 分钟。 7. 弃上清,悬浮 DNA 沉淀于 2ml TE 缓冲液中。这一步中也许有的沉淀不能溶
26、解。 8. 加 10ml Wizard 大量 DNA 纯化树脂溶液, 并涡旋混合。 9. 每一个样品,使用一支 Wizard 大量柱子 ,柱子的头插在真空器上(Promega 产品,与此配套) 。 10. 将树脂/DNA 混合液转入柱子中,真空抽取树脂/DNA 混合液。 11. 将树脂/DNA 混合液抽干后,加 13ml 柱子洗脱溶液至离心管中, 对管底部的树脂/DNA 进行洗脱(柱子一边旋转一边加入洗脱液),并加入柱子中。 12. 真空抽干所加入的洗脱。 13. 再加 12ml 柱子洗脱液进柱子并抽干。 14. 加入 5ml 80乙醇漂洗柱中的树脂, 柱子真空抽干后将柱子放入用户提供的离心管
27、中,2500rpm(1300g)离心 5 分钟。 15. 取出柱子,真空抽干 5 分钟,再将柱子放入系统中所提供的离心管中,2500rpm(1300g)离心 5 分钟。 16. 在柱子中加入 1.5ml 65-70 预热过的灭菌重蒸水或 TE,1 分钟后 2500rpm(1300g)离心柱子/离心管 5 分钟。 17. 取出柱子,离心管中溶液即为提取的质粒 DNA,可以直接放在离心管中,盖上盖子,储存在 4或-20 备用。注意 1. 在使用之前,系统所提供的柱子洗脱液按 1:1 加入 125ml 95乙醇。 2. 纯化树脂必须混匀后再用。（三）、Sephrose 2B 柱纯化质粒 DNA 碱法
28、提取的质粒 DNA 即使用 RNA 酶处理,仍会含有少量 RNA。当有些试验需无 RNA 污染的 DNA 制品时,则需进行进一步纯化。一般常用 Sepharose 2B 或 Sepharose 4B 进行纯化,该方法具有快速 ,条件温和,重复性好,载体物质可以再利用等优点,因而已广泛用于质粒 DNA 纯化。 1. 将 Sepharose 2B 经含 0.1% SDS 的 TE（pH8.0）平衡后上柱。 2. 将至多 1ml 的 DNA 溶液铺在 Sepharase 2B 柱上。 3. 待 DNA 溶液完全进入柱内后立即在柱的上部连接含有 0.1% SDS 的 TE(pH8.0)贮液瓶。 4.
29、以 1ml 流出液为 1 份进行收集。 5. 对每一管测定其 OD260 值,以确定哪些管中含有质粒 DNA。通常质粒 DNA 在柱上流出的第一个峰中。 6. 合并所有含质粒的洗脱液,用等体积的酚/氯仿(1:1) 抽提,4下 12000g 离心 2 分钟,将上层水相转入新管。 7. 加入 2 倍体积的冰冷无水乙醇,-20 下沉淀 10 分钟,然后 4下 12000g 离心 10 分钟,弃去上清液。 8. 沉淀加 70%乙醇洗涤,4下 12000g 离心 10 分钟,弃去上清液。 9. 沉淀真空抽干,重新溶于 TE 或无菌水中。 注意 在装柱过程中,要防止柱床中出现断裂或气泡现象,要使界面保持平
30、整。对新装成的柱,应用含 0.1% SDS 的 TE 平衡, 以使柱内的凝胶均匀。 第二章 DNA 酶切及凝胶电泳第一节 概 述一. DNA 的限制性内切酶酶切分析限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的 DNA 序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链 DNA。它可分为三类:类和类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化) 作用且依赖于 ATP 的存在。类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的 DNA,而类酶在识别位点上切割 DNA 分子,然后从底物上解离。类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同
31、一识别序列。类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用,它们是重组 DNA 的基础。绝大多数类限制酶识别长度为 4 至 6 个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如 EcoR识别六个核苷酸序列:5- GAATTC-3),有少数酶识别更长的序列或简并序列。类酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割,产生平末端的 DNA 片段(如 Sma:5-CCCGGG-3);有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的 DNA 片段称粘性未端, 如 EcoR切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。 5GAATTC3 5 G AATTC3 3CTTAAG 5 3 CTTAA G5 DNA 纯度、缓冲液、温度条
32、件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。大部分限制性内切酶不受 RNA 或单链 DNA的影响。当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时,会影响其进一步使用,因此在吸取限制性内切酶时,每次都要用新的吸管头。如果采用两种限制性内切酶,必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液,则可同时水解。若需要不同的盐浓度,则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用,随后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也可在第一个酶切反应完成后,用等体积酚/氯仿抽提,加 0.1 倍体积 3mol/L NaAc 和 2 倍体积无水乙醇,混匀后置-70 低温冰箱 30 分钟,离心、干燥并重新溶于缓冲液后
33、进行第二个酶切反应。 DNA 限制性内切酶酶切图谱又称 DNA 的物理图谱,它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成,以直线或环状图式表示。在 DNA 序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA 的无性繁殖、基因文库的构建等工作中,建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节,近年来发展起来的 RFLP(限制性片段长度多态性)技术更是建立在它的基础上。 构建 DNA 限制性内切酶图谱有许多方法。通常结合使用多种限制性内切酶,通过综合分析多种酶单切及不同组合的多种酶同时切所得到的限制性片段大小来确定各种酶的酶切位点及其相对位置。酶切图谱的使用价值依赖于它的准确性和精确程度。 在酶切图谱制作过程中,
34、为了获得条带清晰的电泳图谱,一般 DNA 用量约为 0.5-1g。限制性内切酶的酶解反应最适条件各不相同,各种酶有其相应的酶切缓冲液和最适反应温度(大多数为 37) 。对质粒 DNA 酶切反应而言, 限制性内切酶用量可按标准体系 1g DNA 加 1 单位酶,消化 1-2 小时。但要完全酶解则必须增加酶的用量,一般增加 2-3 倍,甚至更多,反应时间也要适当延长。 二. 凝胶电泳琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离鉴定和纯化 DNA 片段的标准方法。该技术操作简便快速,可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的 DNA 片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromid
35、e, EB)染色,在紫外光下至少可以检出 1-10ng 的 DNA 条带 ,从而可以确定 DNA 片段在凝胶中的位置。此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的 DNA 条带,用于以后的克隆操作。 琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离 DNA 片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从 200bp 至近 50kb 的 DNA 片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段 DNA(5-500bp)效果较好,其分辩力极高,甚至相差 1bp 的 DNA 片段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快,可容纳相对大量的 DNA,但制备和操作比琼脂糖凝
36、胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行 DNA 电泳。 琼脂糖主要在 DNA 制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中,在中性 pH 值下带负电荷的 DNA向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定: 1. DNA 的分子大小: 线状双链 DNA 分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与 DNA 分子量对数成反比,分子越大则所受阻力越大,也越难于在凝胶孔隙中蠕行,因而迁移得越慢。 2. 琼脂糖浓度:一个给定大小的线状 DNA 分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA 电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关
37、系。凝胶浓度的选择取决于 DNA 分子的大小。分离小于 0.5kb 的 DNA 片段所需胶浓度是 1.2-1.5%,分离大于 10kb 的 DNA分子所需胶浓度为 0.3-0.7%, DNA 片段大小间于两者之间则所需胶浓度为 0.8-1.0%。 3. DNA 分子的构象:当 DNA 分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋 DNA 在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋 DNA 移动最快,而线状双链 DNA 移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条 DNA 带难以确定是质粒 DNA 不同构象引起还是因为含有其他 DN
38、A 引起时,可从琼脂糖凝胶上将 DNA 带逐个回收,用同一种限制性内切酶分别水解,然后电泳,如在凝胶上出现相同的 DNA 图谱,则为同一种 DNA。 4. 电源电压:在低电压时,线状 DNA 片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加,不同分子量的 DNA 片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加,琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于 2kb 的 DNA 片段的分辨率达到最大,所加电压不得超过 5v/cm。 5. 嵌入染料的存在:荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的 DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环
39、状 DNA,使其刚性更强,还会使线状 DNA 迁移率降低 15。 6. 离子强度影响:电泳缓冲液的组成及其离子强度影响 DNA 的电泳迁移率。在没有离子存在时( 如误用蒸馏水配制凝胶), 电导率最小,DNA 几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误加 10电泳缓冲液), 则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或 DNA 变性。 对于天然的双链 DNA,常用的几种电泳缓冲液有 TAE含 EDTA (pH8.0)和 Tris-乙酸,TBE(Tris- 硼酸和 EDTA),TPE(Tris-磷酸和EDTA),一般配制成浓缩母液,储于室温。 第二节 材料、设备及试剂一、 材料 DNA: 购买或自行
40、提取纯化; 重组 pBS 质料或 pUC19 质粒; EcoRI 酶及其酶切缓冲液: 购买成品; Hind酶及其酶切缓冲液: 购买成品;琼脂糖(Agarose): 进口或国产的电泳用琼脂糖均可。 二、 设备 水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉或电炉,紫外透射仪, 照相支架, 照相机及其附件。 三、 试剂 1. 5TBE 电泳缓冲液：配方见第一章。 2. 6电泳载样缓冲液：0.25 溴粉蓝 ,40(w/v) 蔗糖水溶液,贮存于 4。 3. 溴化乙锭(EB)溶液母液:将 EB 配制成 10mg/ml,用铝箔或黑纸包裹容器,储于 室温即可。第三节 操作步骤一
41、、 DNA 酶切反应1. 将清洁干燥并经灭菌的 eppendorf 管(最好 0.5ml)编号,用微量移液枪分别加入 DNA 1g 和相应的限制性内切酶反应 10缓冲液2l,再加入重蒸水使总体积为 19l,将管内溶液混匀后加入 1l 酶液,用手指轻弹管壁使溶液混匀,也可用微量离心机甩一下,使溶液集中在管底。此步操作是整个实验成败的关键,要防止错加,漏加。使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间,以免活性降低。 2. 混匀反应体系后,将 eppendorf 管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上）,37水浴保温 2-3 小时,使酶切反应完全。 3. 每管加入 2l 0.1mol/L EDT
42、A(pH8.0),混匀,以停止反应,置于冰箱中保存备用。 二、DNA 分子量标准的制备采用 EcoR或 Hind酶解所得的 DNA 片段来作为电泳时的分子量标准。 DNA 为长度约 50kb 的双链 DNA 分子,其商品溶液浓度为 0.5mg/ml,酶解反应操作如上述。HindIII 切割 DNA 后得到 8 个片段,长度分别为 23.1, 9.4, 6.6, 4.4, 2.3, 2.0, 0.56 和 0.12kb。EcoRI 切割 lDNA 后得到 6 个片段,长度 分别为 21.2, 7.4, 5.8, 5.6, 4.9 和 2.5kb。 三、 琼脂糖凝胶的制备 1. 取 5TBE 缓冲
43、液 20ml 加水至 200ml,配制成 0.5TBE 稀释缓冲液,待用。 2. 胶液的制备：称取 0.4g 琼脂糖,置于 200ml 锥形瓶中,加入 50ml 0.5TBE 稀释缓冲液,放入微波炉里(或电炉上)加热至琼脂糖全部熔化,取出摇匀,此为 0.8琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。 3. 胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏(宽约 1cm)紧密封住。将封好的胶槽置于水平支持物上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持 1mm 左右的间隙。 向冷却至 50-60的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(EB)溶液使
44、其终浓度为 0.5g /ml(也可不把 EB 加入凝胶中,而是电泳后再用 0.5g/ml 的 EB 溶液浸泡染色 )。用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧 ,待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内,使胶液形成均匀的胶层。倒胶时的温度不可太低,否则凝固不均匀,速度也不可太快,否则容易出现气泡。待胶完全凝固后拨出梳子,注意不要损伤梳底部的凝胶,然后向槽内加入 0.5TBE 稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。因边缘效应样品槽附近会有一些隆起,阻碍缓冲液进入样品槽中,所以要注意保证样品槽中应注满缓冲液。 4. 加样：取 10l 酶解液与 2l 6载样液混匀,用微量移液枪小心加入样品
45、槽中。若 DNA 含量偏低,则可依上述比例增加上样量,但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要更换 tip 头,以防止互相污染,注意上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。 5. 电泳：加完样后,合上电泳槽盖,立即接通电源。控制电压保持在 60-80V,电流在 40mA 以上。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm 时,停止电泳。 6. 染色：未加 EB 的胶板在电泳完毕后移入 0.5g/ml 的 EB 溶液中,室温下染色 20-25 分钟。 7. 观察和拍照：在波长为 254nm 的长波长紫外灯下观察染色后的或已加有 EB 的电泳胶板。DNA 存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光
46、条带。紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩,以免损伤眼睛。 经照相机镜头加上近摄镜片和红色滤光片后将相机固定于照相架上,采用全色胶片,光圈 5.6,曝光时间 10-120 秒(根据荧光条带的深浅选择 )。 8. DNA 分子量标准曲线的制作：在放大的电泳照片上,以样品槽为起点,用卡尺测量 DNA 的 EcoR和 Hind酶切片段的迁移距离,以厘米为单位。以核苷酸数的常用对数为纵坐标,以迁移距离为横坐标,在坐标纸上绘出连结各点的平滑曲线,即为该电泳条件下 DNA 分子量的标准曲线。 9. DNA 酶切片段大小的测定：在放大的电泳照片上,用卡尺量出 DNA 样品各片段的迁移距离,根据此数值,
47、在 DNA 分子量标准曲线上查出相应的对数值,进一步计算出各片段的分子量大小(若用单对数坐标纸来绘制标准曲线,则可根据迁移距离直接查出 DNA片段的大小)。反之,若已知 DNA 片段的大小亦可由标准曲线上查出它预计的迁移距离。 10. DNA 酶切片段排列顺序的确定：根据单酶切,双酶切和多酶切的电泳分析结果,对照 DNA 酶切片段大小的数据进行逻辑推理,然后确定各酶切片段的排列顺序和各酶切位点的相对位置。以环状图或直线图表示,即成该 DNA 分子的限制性内切酶图谱。 注意 1. 酶切时所加的 DNA 溶液体积不能太大,否则 DNA 溶液中其他成分会干扰酶反应。 2. 酶活力通常用酶单位（U）表
48、示,酶单位的定义是：在最适反应条件下,1 小时完全降解 1mg lDNA 的酶量为一个单位,但是许多实验制备的 DNA 不象 lDNA 那样易于降解 ,需适当增加酶的使用量。反应液中加入过量的酶是不合适的,除考虑成本外,酶液中的微量杂质可能干扰随后的反应。 3. 市场销售的酶一般浓度很大,为节约起见,使用时可事先用酶反应缓冲液（1）进行稀释。另外,酶通常保存在 50%的甘油中,实验中,应将反应液中甘油浓度控制在 1/10 之下,否则,酶活性将受影响。 4. 观察 DNA 离不开紫外透射仪,可是紫外光对 DNA 分子有切割作用。从胶上回收 DNA 时,应尽量缩短光照时间并采用长波长紫外灯(300
49、-360nm）,以减少紫外光切割 DNA。 5. EB 是强诱变剂并有中等毒性,配制和使用时都应戴手套,并且不要把 EB 洒到桌面或地面上。凡是沾污了 EB 的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。 6. 当 EB 太多,胶染色过深,DNA 带看不清时,可将胶放入蒸馏水冲泡,30 分钟后再观察。 第三章 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化第一节 概 述 在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的 mob 基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌,需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源 DNA。转化(Transformation)是将外源 DNA 分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。 转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株,即不含限
