1、PI 单染色法流 式 细 胞 仪 检 测 细 胞 凋 亡 PI 单 染 色 法 基 本 原 理 其 原 理 主 要 是 根 据 细 胞 凋 亡 时 在 细 胞 、 亚 细 胞 和 分 子 水 平 上 所 发 生 的 特征 性 改 变 。 这 些 改 变 包 括 细 胞 核 的 改 变 、 细 胞 器 的 改 变 、 细 胞 膜 成 分 的 改 变和 细 胞 形 态 的 改 变 等 ， 其 中 细 胞 核 的 改 变 最 具 特 征 性 ， 主 要 包 括 以 下 几 个 方面 ： 1. 细 胞 核 的 改 变 ： 由 于 凋 亡 细 胞 核 的 改 变 ， 造 成 各 种 染 色 体 荧 光
2、染 料 对凋 亡 细 胞 DNA 可 染 性 发 生 改 变 。 研 究 表 明 ， 用 各 种 染 色 体 荧 光 染 料 对 经 固 定的 凋 亡 细 胞 进 行 染 色 ， 其 DNA 可 染 性 降 低 。 许 多 学 者 把 这 种 DNA 可 染 性 的 降低 认 为 是 凋 亡 细 胞 的 标 志 之 一 。 2. 光 散 射 特 性 ： 凋 亡 细 胞 形 态 上 的 改 变 影 响 它 们 的 光 散 射 特 性 。 在 流 式细 胞 仪 上 ， 前 散 射 光 与 细 胞 的 大 小 有 关 ， 而 侧 散 射 光 反 映 的 是 光 在 细 胞 内 的折 射 作 用 ，
3、与 细 胞 内 的 颗 粒 多 少 有 关 。 在 细 胞 凋 亡 时 ， 细 胞 固 缩 ， 体 积 变 小 ，故 前 散 射 光 降 低 ， 这 一 特 性 往 往 被 认 为 是 凋 亡 细 胞 的 特 点 之 一 。 此 外 细 胞 凋亡 时 由 于 染 色 体 降 解 ， 核 破 裂 形 成 ， 细 胞 内 颗 粒 往 往 增 多 ， 故 凋 亡 细 胞 侧 散射 光 常 增 加 。 细 胞 坏 死 时 ， 由 于 细 胞 肿 胀 ， 其 前 散 射 光 增 大 ； 侧 散 射 光 在 细胞 坏 死 时 也 增 大 ， 因 此 可 根 据 前 散 射 光 和 侧 散 射 光 区 别
4、凋 亡 细 胞 和 坏 死 细 胞 。但 需 要 注 意 的 是 ， 根 据 前 散 射 光 和 侧 散 射 光 判 断 凋 亡 细 胞 的 可 靠 性 受 被 检 测细 胞 形 态 上 的 均 一 性 和 核 胞 浆 比 率 影 响 很 大 。 因 此 在 某 些 淋 巴 细 胞 凋 亡 中 ，用 光 散 射 特 性 检 测 凋 亡 的 可 靠 性 较 好 ， 而 在 肿 瘤 细 胞 凋 亡 中 ， 其 可 靠 性 就 较差 。 根 据 光 散 射 特 性 检 测 凋 亡 细 胞 最 主 要 的 优 点 是 可 以 将 光 散 射 特 性 与 细 胞的 表 面 免 疫 荧 光 分 析 结 合
5、 起 来 ， 用 以 区 别 经 这 些 特 殊 处 理 发 生 选 择 性 凋 亡 的淋 巴 细 胞 亚 型 。 也 可 用 于 活 细 胞 的 分 类 。 试 剂 与 仪 器 PBS 溶 液 ； PI 染 液 ： 将 PI 溶 于 PBS（ pH7.4） 中 ， 终 浓 度 为 100ug/ml。 用 棕 色 瓶 4避 光 保 存 。 70%乙 醇 400 目 筛 网 流 式 细 胞 仪 实 验 步 骤 1. 收 集 细 胞 数 目 约 （ 1 5） 106 个 /mL ， 500 1000 r/min 离 心5min， 弃 去 培 养 液 。 2. 3ml PBS 洗 涤 1 次 。 3
6、. 离 心 去 PBS， 加 入 冰 预 冷 的 70%的 乙 醇 固 定 ， 4 ， 12 小 时 。 4. 离 心 弃 去 固 定 液 ， 3mlPBS 重 悬 5min。 5. 400 目 的 筛 网 过 滤 1 次 ， 5001000r/min 离 心 5min， 弃 去 PBS。 6. 用 1ml PI 染 液 染 色 ， 4 避 光 30min。 7. 流 式 细 胞 仪 检 测 ： PI 用 氩 离 子 激 发 荧 光 ， 激 光 光 波 波 长 为 488nm，发 射 光 波 波 长 大 于 630nm， 产 生 红 色 荧 光 分 析 PI 荧 光 强 度 的 直 方 图 也
7、 可 分 析前 散 射 光 对 侧 散 射 光 的 散 点 图 。 8. 结 果 判 断 ： 在 前 散 射 光 对 侧 散 射 光 的 散 点 图 或 地 形 图 上 ， 凋 亡 细 胞 与正 常 细 胞 相 比 ， 前 散 射 光 降 低 ， 而 侧 散 射 光 可 高 可 低 ， 与 细 胞 的 类 型 有 关 ；在 分 析 PI 荧 光 的 直 方 图 时 ， 先 用 门 技 术 排 除 成 双 或 聚 集 的 细 胞 以 及 发 微 弱 荧光 的 细 胞 碎 片 ， 在 PI 荧 光 的 直 方 图 上 ， 凋 亡 细 胞 在 G1/G0 期 前 出 现 一 亚 二倍 体 峰 。 如
8、 以 G1/G0 期 所 在 位 置 的 荧 光 强 度 为 1.0， 则 一 个 典 型 的 凋 亡 细 胞样 本 其 亚 二 倍 体 峰 的 荧 光 强 度 为 0.45， 可 用 鸡 和 鲑 鱼 的 红 细 胞 的 PI 荧 光 强度 做 参 照 标 准 ， 两 者 分 别 为 0.35 和 0.7， 可 以 确 保 在 两 者 之 间 的 不 是 细 胞 碎片 而 是 完 整 的 细 胞 。 注 意 事 项 ： 细 胞 凋 亡 时 ， 其 DNA 可 染 性 降 低 被 认 为 是 凋 亡 细 胞 的 标 志 之一 ， 但 这 种 DNA 可 染 性 降 低 也 可 能 是 因 为 D
9、NA 含 量 的 降 低 ， 或 者 是 因 为 DNA结 构 的 改 变 使 其 与 染 料 结 合 的 能 力 发 生 改 变 所 致 。 在 分 析 结 果 时 应 该 注 意 。 PI 介 绍 3,8-Diamino-5-3-(diethylmethylammonio)propyl-6-phenylphenanthridinium diiodide 3,8-二 氨 基 -5-3-(二 乙 基 家 氨 基 )丙 基 -6-苯 基 啡 啶 二 碘 荧 光 染 料 PI（ 碘 化 丙 啶 ） 是 一 种 可 对 DNA 染 色 的 细 胞 核 染 色 试 剂 ， 常 用于 细 胞 凋 亡 检
10、 测 ， 英 文 全 称 是 Propidium Iodide。 它 是 一 种 溴 化 乙 啶 的 类 似物 ， 在 嵌 入 双 链 DNA 后 释 放 红 色 荧 光 。 尽 管 PI 不 能 通 过 活 细 胞 膜 ， 但 却 能穿 过 破 损 的 细 胞 膜 而 对 核 染 色 。 PI 经 常 被 用 来 与 Calcein-AM 或 者 FDA 等 荧光 探 针 一 起 使 用 ， 能 同 时 对 活 细 胞 和 死 细 胞 染 色 。 PI-DNA 复 合 物 的 激 发 和 发射 波 长 分 别 为 535 nm 和 615 nm。 分 子 式 : C27H34I2N4 分 子
11、 量 : 668.39 外 观 : 红 棕 色 粉 末 别 名 : PI 储 存 条 件 : -20 运 输 条 件 : 室 温 扩展阅读： 1 流式细胞仪检测细胞凋亡的方法还包括:Heochst 33342/PI 双染色法和 Annexin V/PI 双染色法。开放分类： 流式细胞仪，细胞凋亡， PI 单染法 PI 分不清晚期凋亡和已经死的细胞，在做有关凋亡的流式检测的时候利用的是磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V 法）磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中(图 3
12、)。Annexin-V 是一种分子 量为 3536KD 的 Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与 PS 高亲和力特异性结合。将 Annexin-V 进行荧光素（FITC、PE）或 biotin 标记， 以标记了的 Annexin-V 作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。 碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI 能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将 Annexin-V 与 PI 匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。细胞固定后用 PI 染色，因为 PI 特异性结合于细胞
13、DNA，荧光强度与 PI 的结合量呈良好的线性关系。由于凋亡细胞核酸内切酶活化，DNA 降解，细胞 DNA 减少，因而可在 G0/G1峰前出现一个亚二倍体峰，也就是凋亡峰。 碘化丙啶(PI) PI 可嵌入到双链 DNA 和 RNA 碱基对中并与之结合，但对碱基无特异性选择 , 最大吸收光谱是 493nm，最大发射光谱是 630nm，呈红色荧光。 PI、可与细胞核 DNA（或 RNA）结合。但是 PI 不能通过正常的细胞膜，故细胞在处于坏死或晚期调亡时细胞膜被破坏，这时可为 PI 着红色。DAPI 作用机理与溴化乙锭（EB ）等染色剂的机理类似：与 DNA 双螺旋的凹槽部分可以发生相互作用，从而与 DNA 的双链紧密结合。结合后产生的荧光基团的吸收峰是 358nm 而散射峰是 461nm，正好 UV（紫外光）的激发波长是 356nm。
