hoechst PI染色.doc

1、2008/11/09 09:55PI、Hoechst33342 均可与细胞核 DNA（或 RNA）结合。但是 PI 不能通过正常的细胞膜，Hoechst 则为膜通透性的荧光染料，故细胞在处于坏死或晚期调亡时细胞膜被破坏，这时可为 PI 着红色。正常细胞和中早期调亡细胞均可被 Hoechst 着色，但是正常细胞核的 Hoechst 着色的形态呈圆形，淡兰色，内有较深的兰色颗粒；而调亡细胞的核由于浓集而呈亮兰色，或核呈分叶，碎片状，边集。故 PI 着色为坏死细胞；亮兰色，或核呈分叶状，边集的 Hoechst 着色的为调亡细胞。电子天平准确称取 1mg 碘化丙啶（ propidium iodide，

2、PI）溶于 10ml PBS（PH 7.2） ，成100ug/ml 的储备液，用前等量混合（注意避光）protocol:1、收集细胞，数量需 1210E6 个（悬浮细胞直接吹起即可，对于贴壁细胞用胰酶消化时，最好用 DMEM+胰酶消化,且消化过程中不要去移动瓶子，防止消化所形成的细胞团影响后面的染色及分析） ，离心，11,000rpm，5min。2、 用 1ml 冰冷的 PBS 重悬后，离心：11,000rpm，5min。3、用 200l 冰冷的 PBS 重悬后，用加样器混匀后，缓慢的加入含有 4ml 冰冷的 70乙醇的 10ml 离心管中，边加边摇匀。20，过夜。 （或者置 4，1h 后进行

3、下一步）4、1,500rpm，10min，小心弃上清后，用 1ml 冰冷的 PBS 重悬，1,500rpm ，5min。小心弃上清。5、 加入含有 40g/ml 的 PI，100g/ml 的 RNase 的 PBS 溶液 500l，37，培养30min1h。混匀。溶液配方：PBS 910lPI 80lRNase 10l共 1ml6、过滤，供流式检测。Hoechst 33342/PI 双染色法紫外光激发, Hoechst-PI 双染在荧光显微镜下可见 4 种细胞形态:活细胞(VN) ,染成蓝色,核呈正常结构;早期凋亡细胞(VA) ,染成蓝色,核呈固缩状或圆珠状;晚期凋亡细胞(NVA) ,也被染成

4、红色,但可见明显的染色质凝集。非凋亡的死亡细胞(NVN) ,染成红色,核呈正常结构;贴壁细胞：1、培养细胞中加入 hoechst 染液，终浓度 5g/ml；2、37，避光染色 10min，3、继续加入的 PI 染液，终浓度 15g/ml，4、4，避光反应 10min，5、荧光显微镜下观察，照相。悬浮细胞：1.悬浮生长的细胞在培养状态下加入 Heochst 33342，终浓度为 1g/ml ；帖壁生长的细胞用含有 0.02EDTA 的 0.2 5胰蛋白酶消化成单细胞悬液，离心，弃上清，用 1ml 全培养液重悬细胞，加入Heochst 33342，终浓度为 1g/ ml，37孵育 710min。2

5、4 5001000r/min 离心弃去染液。3加入 1.0ml PI 染液，4避光染色 15min。4400 目的筛网过滤 1 次。5流式细胞仪分析。另外这是活细胞染色，还有固定后染色的：细胞处理完毕用甲醇：冰醋酸（3：1）在4 度固定 5min 后，PBS 漂洗，进行以上操作。先染色后固定：Hoechst33258 染色法1原代细胞培养，细胞学涂片或细胞甩片机制备的单细胞片。2细胞固定液 4固定 5min。3蒸馏水稍洗后，点加 Hoechst33258 染色液，10min。4蒸馏水洗片后，用滤纸沾去多余液体。5封片剂封片后荧光显微镜观察。Hoechst33342 染色法1将 Hoechst3

6、3342 加入培养的细胞中，终浓度为 10g/ml 37孵育 30min。24的多聚甲醛和培养液以 1：3 混合，使多聚甲醛的浓度为 1，固定细胞510min。3固定好后，将细胞悬液涂在载玻片加盖玻片。4荧光显微镜激发滤片选用 UV 激发滤片，阻断滤片为 400500nm 。以上是先将细胞染色后再行固定观察的方法，也可先固定后染色：1收集（0.53.0）106 个细胞，5001000r/min，离心 5min 去上清。2PBS 洗 1 次，5001000r/min，离心 5min 去 PBS。3用 3多聚甲醛 50l 重悬细胞，室温下固定 10min。4PBS 洗 1 次，5001000r/m

7、in 离心 5min 去 PBS。5用 15l 的 Hoechst33258 或 33342 重悬细胞，终浓度为 16g/ml ，孵育 15min。6取 10l 放在玻片上，荧光显微镜下观察，可数 500 个细胞，计算调亡率。注意事项：1、度乙醇固定细胞过夜，固定后可以放在20 度冰箱，一般能保存几个月；2、染色前要用 DNA 抽提缓冲液（PC buffer）作用分钟， ；3、加的量按照 1PI，106 个细胞 5ul ；4、加 RNAase 是为了消化 RNA，以免影响 DNA 分析的结果。操作过程，不用一定强调无菌，但是干净点没错的。一般来说都采用 用 Hoechest-PI 双染，正常细

8、胞对染料有拒染性，萤光着色浅，凋亡细胞主要摄取 Hoechest 染料呈现强兰光，而坏死细胞主要摄取 PI 呈红色荧光。我的细胞已经做了盖玻片在六孔板里面的爬片 并且加了 95%酒精固定 下一步打算做 Hoechst-PI 双染检测细胞凋亡 请教具体步骤 以及药物浓度 是不是这样固定后1.用 PBS 漂洗，加入 hoechst 染液，终浓度 5g/ml；2、37 ，避光染色 10min，3、继续加入的 PI 染液，终浓度 15g/ml，4、4，避光反应 10min，5、荧光显微镜下观察，照相。激发波长：hochest 用紫外激发；PI 用绿光激发荧光显微镜下观察并计数凋亡指数（apoptoti

9、c index：percentage of apoptotic cells）。每个样本随机观察 4 个视野进行计数。计数 1000 个细胞，凋亡指数凋亡细胞数 /1000 100。凋亡指数取前后 2 次计数的平均值。实验重复 3 次。其中 hoechsts33258 用于细胞固定后再染色，而 hoechst33342 则可以对活细胞直接进行染色！暂时了解了这么多，希望做过或是会做的大侠不吝赐教 PI 分析细胞周期及凋亡率1、200g 离心 10min 收集细胞；2、弃去上清，PBS 漂洗一次，将细胞重悬于预冷的 80%乙醇中，-20C 固定 24h 以上；3、进行流式细胞仪检测前，200g 离

10、心 10min 收集固定后的细胞；4、PBS 洗涤一次，200g 离心 10min 收集细胞；5、将细胞重悬于含 100ug/ml RNase A 和 50ug/ml PI 的 PBS 中，室温孵育 30min；6、将经 PI 染色和 RNase A 消化后的细胞悬液用过滤后即可利用流式细胞仪进行细胞周期分布和凋亡细胞定量的分析。 三、试剂盒以外自备仪器和试剂荧光显微镜或流式细胞仪、低速离心机、微量移液器、1.5m L 离心管、载玻片、盖玻片四、保存条件：4保存，Hoechst 33342 和碘化丙啶需避光保存。五、注意事项：1、 荧光染料都存在淬灭的问题，建议染色后尽量当天完成检测。活细胞或

11、组织染色后宜立即观察。2、 在红色荧光对兰色荧光散点图上，还可见到细胞凋亡区向细胞坏死区迁移的轨迹，可能是凋亡细胞的 DNA 进一步降解的缘故。3、 用 Heochst 33342 染料与细胞孵育的时间不宜过长，一般控制在 20min 之内为宜。如果太长可引起 Heochst 33342 的发射光谱由蓝光向红光的迁移，导致红色荧光与兰色荧光的比例改变，从而影响结果的判断。染色时间严格控制，染色过久可导致假阳性。4、 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。六、操作规程1、 溶液 A 工作液的配制：使用前，取试验盒中 10溶液 A 原液用蒸馏水稀释 10 倍，即得溶液 A 工作液。2、

12、 按照常规的方法收集 5105左右的细胞， 将细胞悬浮于 1mL 培养基中，再加入 10L Heochst 33342 溶液，混匀，37 0C 孵育 515 min。3、 第 2 步的细胞于 40C 离心（ 2000rpm，5min）弃去上清液。4、 往第 3 步的细胞中加入 1.0mL 溶液 A 工作液，加入 5L PI 染液，室温避光放置 515min 后混匀； 5、 观察与分析a、荧光显微镜观察：Heochst 33342 用氪激光激发的紫外光，激发波长为 352nm，发射波长为 400500nm，产生兰色荧光；PI 用氩离子激光激发荧光，激发光波波长为 488nm，发射光波波长大于 6

13、30nm，产生红色荧光。b、 流式细胞仪分析：Heochst 33342 用氪激光激发的紫外光，激发波长为 352nm，发射波长为 400500nm，产生兰色荧光；PI 用氩离子激光激发荧光，激发光波波长为 488nm，发射光波波长大于 630nm，产生红色荧光。分析兰色荧光对红色荧光的散点图或地形图。 结果判断：在兰色荧光对红色荧光的散点图上，结果为：正常细胞为低蓝光/低红光，凋亡细胞为高蓝光/低红光，坏死细胞为低蓝光/高红光。基本原理经固定的凋亡细胞其染色体荧光染料的 DNA 可染性性下降。细胞一经固定就不再是活细胞，而且细胞固定过程对细胞膜的通透性也有影响。因此发展了用“细胞活性”鉴定染

14、料染色的流式细胞仪检测方法。这些方法细胞不经固定就直接用 DNA 染料染色，且染料的浓度要比固定细胞所用的浓度要低得多。流式细胞仪通常根据细胞膜完整性将细胞分为“活细胞”和“死细胞” ，因此正常细胞和凋亡细胞归为活细胞。活细胞染料如 Hoechst 33342 能少许进入正常细胞膜而对细胞没有太大得细胞毒作用。Hoechst 33342 在凋亡细胞中的荧光强度要比正常细胞中要高，Hoechst 33342 在凋亡细胞中的荧光强度增高的机制与凋亡细胞膜通透性发生改变有关，凋亡细胞早期细胞膜的完整性没有明显性改变，但细胞膜的通透性已有增强，因此进入凋亡细胞中的 Hoechst 33342 比正常细

15、胞的多。此外，还与凋亡细胞的染色体 DNA 的结构发生了改变从而使该染料能更有效地与 DNA 结合以及凋亡细胞膜上的 p-糖蛋白泵功能受到损伤不能有效地将 Hoechst 33342 排出到细胞外使之在细胞内积累增加等有关。既然 Hoechst 33342 进入凋亡细胞中比正常细胞更容易，而 EB、PI或 7-AAD 等染料是不能进入细胞膜完整的活细胞中，即正常细胞和凋亡细胞在不经固定的情况下对这些染料是拒染，坏死细胞由于膜完整性在早期即已破损，可被这些染料染色。根据这些特性，用 Hoechst 33342 结合 PI 或 EB 等染料对凋亡细胞进行双染色，就可在流式细胞仪上将正常细胞、凋亡细

16、胞和坏死细胞区别开来。在双变量流式细胞仪的散点图上，这三群细胞表现分别为：正常细胞为低蓝色/低红色（Hoechst 33342+/PI+） ，凋亡细胞为高蓝色/低红色（Hoechst 33342+/PI+） ，坏死细胞为低蓝色/高红色（Hoechst 33342+/PI+） 。 临床实验室 试剂与仪器 Heochst 33342 染液：用 PBS 配成 10ug/ml 的储存液浓度，4避光保存； PI 染液 ：用 PBS 配成 5ug/ml 浓度，4避光保存。 400 目的筛网 流式细胞仪实验步骤1. 悬浮生长的细胞在培养的状态下加入 Heochst 33342 ，终浓度为 1ug/ml； 3

17、7孵育 710min。2. 低温 500 1000r/min 离心 5min 弃去染液。3. 加入 1.0ml PI 染液，4避光染色 15min。4. 400 目的筛网过滤 1 次。5. 流式细胞仪分析：Heochst 33342 用氪激光激发的紫外线荧光，激发光波波长为352nm，发射光波波长为 400 500nm，产生兰色荧光；PI 用氩离子激光激发荧光，激发光波波长为 488nm，发射光波波长大于 630nm，产生红色荧光。分析兰色荧光对红色荧光的散点图或地形图。6. 结果判断：在兰色荧光对红色荧光的散点图上，结果为：正常细胞为低蓝光/低红光，凋亡细胞为高蓝光/低红光，坏死细胞为低蓝光

18、 /高红光。注意事项1. 在红色荧光对兰色荧光散点图上，还可见到细胞凋亡区向细胞坏死区迁移的轨迹，可能是凋亡细胞的 DNA 进一步降解的缘故。2. 用 Heochst 33342 染料与细胞孵育的时间不宜过长，一般控制在 20min 之内为宜。如果太长可引起 Heochst 33342 的发射光谱由蓝光向红光的迁移，导致红色荧光与兰色荧光的比例改变，从而影响结果的判断。 clin-lab.文章来自临床实验室仪器信息网(www.Clin-Lab.Com) - 详文链接：http:/www.clin- Hoechst 33342 /PI 双染试剂盒点击次数：1282 发布时间：2010-1-4 1

19、0:25:39细胞凋亡荧光 Hoechst 33342 /PI 双染试剂盒一、原理荧光染料 Hoechst 33342 能少许进入正常细胞膜，使其染上低蓝色，而凋亡细胞的膜通透性增强，因此进入凋亡细胞中的 Hoechst 33342 比正常细胞的多，荧光强度要比正常细胞中要高，此外，凋亡细胞的染色体 DNA 的结构发生了改变从而使该染料能更有效地与 DNA 结合，并且凋亡细胞膜上的 p-糖蛋白泵功能受到损伤不能有效地将 Hoechst 33342 排出到细胞外使之在细胞内积累增加等都使凋亡细胞的蓝色荧光增强。而PI 染料是不能进入细胞膜完整的正常细胞和凋亡细胞中，即活细胞对 PI 染料拒染，而

20、坏死细胞由于膜完整性在早期即已破损，可被 PI 染料染色。根据这些特性，用 Hoechst 33342 结合 PI 染料对凋亡细胞进行双染色，就可在流式细胞仪上将正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞区别开来。在双变量流式细胞仪的散点图上，这三群细胞表现分别为：正常细胞为低蓝色/低红色（Hoechst 33342+/PI+），凋亡细胞为高蓝色/低红色（Hoechst33342+/PI+），坏死细胞为低蓝色/高红色（Hoechst 33342+/PI+）。二、试剂盒组份组份 100 assaysHeochst 33342 染液 1.0mLPropidium Iodide （PI） 500 ul10PBS

21、10 mL三、操作步骤1. 悬浮生长的细胞离心收集，固定培养的细胞消化收集后，将 105106 个细胞悬浮于 1ml 培养基中，再加入10ul Heochst 33342 染液，混匀，370C 孵育 5-15 min；2. 细胞于 40C 500 1000r/min 离心 5min 弃去上清液；3. 加入 1.0ml PBS 悬浮细胞，加入 5 ul PI 染液，避光混匀；4 流式细胞仪分析或荧光显微镜观察：Heochst 33342 用氪激光激发的紫外光，激发波长为 352nm，发射波长为 400 500nm，产生兰色荧光；PI 用氩离子激光激发荧光，激发光波波长为 488nm，发射光波波长

22、大于 630nm，产生红色荧光。分析兰色荧光对红色荧光的散点图或地形图。结果判断：在兰色荧光对红色荧光的散点图上，结果为：正常细胞为低蓝光/低红光，凋亡细胞为高蓝光/低红光，坏死细胞为低蓝光/高红光。四、注意事项1. 在红色荧光对兰色荧光散点图上，还可见到细胞凋亡区向细胞坏死区迁移的轨迹，可能是凋亡细胞的 DNA进一步降解的缘故。2. 用 Heochst 33342 染料与细胞孵育的时间不宜过长，一般控制在 20min 之内为宜。如果太长可引起 Heochst33342 的发射光谱由蓝光向红光的迁移，导致红色荧光与兰色荧光的比例改变，从而影响结果的判断。3 Propidium Iodide （PI）有毒，操作时要戴手套五、储存 置于 40C 避光，可保存一年。