1、一、为了产生以其优越的抗肿瘤活性化合物,降低了毒性,一系列的它的合成和 5-FU deoxypodophyllotoxin 耦合 40-demethyl-4 -dexoypodophyllotoxin 与 N -(5-fluorouracil-N1-ly 乙酸)-氨基酸 (或 5-fluorouracil-N1-ly 醋酸酸)。这些化合物的细胞毒作用对四人胃癌细胞株(HL-60,- 549,HeLa和 SiHa)进行了评估 ,结果表明,这些化合物方面更有效细胞毒性比父母任何一方或复合结合 VP-16 和 5-FU 抗癌药物。此外, 我们发现14 d 诱导的细胞周期阻滞 G2 / M 期的陪同下
2、在549 个细胞凋亡、 14 dcaspase-3 激活和 7。这些结果表明,caspase-mediated 途径参与 14 d诱导细胞凋亡的机制。二、介绍1、癌症是一种主要的全球健康问题,代表全球第二大死亡原因 1。根据学-信息来自世界卫生组织(WHO),据估计将有 1200 万人死于癌症。在近几年来 ,改善了疾病的预防与治疗降低癌症的死亡,和大量的化疗药物已经发展到治疗癌症。2、类(PPT,1),一个自然发生的 cyclolignan iso -从 Podophyllum 草拟的物种, 是一个著名的细胞毒性 deriva -保守的,作为一种有效的 anti-microtubule 代理2
3、。尽管作为一个潜在使用药用药物人体试验使用了由于其全身毒性停止3 。在过去的 30 年,广泛的结构改性已经导致了类发展抗癌药物的临床价值,eto -poside(VP-16,2),teniposide(VM-26,3)和水溶性种,磷酸甙(4)。这些药物是目前临床用于治疗小细胞肺癌,睪丸癌、急性白血病、爱滋病相关性卡波济氏肉瘤和淋巴瘤。这细胞毒性机制是 VP-16 抑制淋巴 II(顶部 2)不同的是,家长 compoundwhich inhibitsmitosis4.VP -通过加强诱导细胞死亡 16 前 II-mediated DNA通过稳定的乳沟瞬态 DNA /顶部 IIapp 的复杂。在这
4、样一个复杂的、DNA 裂解两者兼具股及中共价与酶;高档 II 的毒药防止它游离5 。近年来的研究表明VP-16 抗肿瘤活性的主要是由于其抑制作用一个顶尖的二世,而这种致癌作用被归因于b 碘6。此外,VP-16 同意几个潜在的候选药物在临床应用基于 PPT试验中,如、NK - 611(5)、GL - 331(6),tafluposide(F11782,7)F14512(8)(图。1)。其中,F11782 是顶尖的双重抑制剂-这会 oisomerases I、II 绑定的酶DNA,但不稳定复杂的裂解7,8。这spermine-conjugated epipodophyllotoxin 衍生 F14
5、512一个淋巴细胞毒,利用二内源多胺的交通工具系统(PTS)肿瘤细胞对目标优先9,10。3、Deoxypodophyllotoxin(结合、 9),模拟的 PPT,拥有潜在的 anti-proliferative 和抗肿瘤活性在不同细胞类型11 e13,以及抗滤过性病原体14和15活动。据透露,抑制 tubulin polymeri 结合-G2 / M 和归纳了细胞周期阻滞, 紧随其后的是细胞凋亡的机制通过多种细胞过程,涉及的活化使用自动柜员机、亚洲及 Bax 的影响,caspase-3 激活和 7,和积累的 PTEN 导致抑制蛋白激酶 b 等路径16、17。此外,研究发现 ,也 inhibi
6、tsmigration 结合MMP-9 MAPK 途径,通过 HASMC TNF-a-induced18中。4、在临床上,通常被用来作为抗癌药物是合适的不同的组合药物来治疗癌症,因为只有几个肿瘤是不够灵敏,由单个药物治愈 (19)。许多组合,为共同药物,在临床使用由一个 antimetabolite 与一个或多个其他抗癌代理人。一个共同的药物通常由两种不同的作用药物配合的直接或通过一个连接器20。为了生成更有效的抗癌药物基于 PPT,许多药理学家和化学家已经合成大量的 conju -盖茨和其他抗肿瘤药物的 PPT,如它的podophyllotoxin-camptothecin21,taxoid
7、 - epipodophyllotoxin22,23polymer-linked 类,- - - - - - - - - - - - vinorelbine 旧历phyllotoxin24,thiocolchicine-podophyllotoxin25,biolog -耦合,大多数的这些检查显示它展出体外细胞毒性比优于母体化合物 PPT。5、最近,我们有一些类报道它与 antimetabolite 5-FU26 e30的结合和衍生品31,32 岁 。我们持续努力寻找 newcompoundswith 强有力的活动和 lowtoxicity fromnatural 产品, 考虑氨基酸经常使用一
8、些药物载体车辆因其良好的水溶 intomammalian 积极组织移植时,在这部作品中,我们描述了合成一系列的物结合 5-FU 以适当的加入和氨基酸进行试验和衬垫细胞毒性对一组四人胃癌细胞株。此外,复合 14 dwas 对细胞周期的影响发展、促进肿瘤细胞凋亡、传授给 caspase-3 和 7。三、结果与讨论1、化学合成合成路线的第一个参与目标化合物代 5-Fluorouracil-N1-ly 醋酸 (10)和氨基酸酸衍生物 12 腹主动脉肠瘘,他们从 5-FU 合成参考(方案 1)报道30,33。简单地说,5-FU 是治疗开始时 2-chloride 醋酸水溶液在他面前氢氧化钾负担复合 10
9、。活性酯 11通过酯化反应的是第十 p-nitrophenol 使用吗N,N -dicyclohexylcarbodiimide(DCC)在干燥的氮、N-dimethylforma -心灵(DMF)。中间的 11 进一步反应 ,appro -私人氨基酸在碱性 DMF-H2O 溶剂 N -(5 -产量fluorouracil-N1-ly 乙酰 )-amino 酸 12 腹主动脉肠瘘。4-dexoydopodophyllotoxin 进行合成物从 40 关键中间体-demethy-4-deoxypodophyllotoxin(DDPT,13),这是在我们准备 previ 描述-程序不断报道31。中
10、间的 DDPT 连在一起不同的 N -(5-fluorouracil-N1-ly 乙酸 )-amino 酸(或 5 -Fluorouracil-N1-ly 醋酸 )和 4 - DCC 面前氨基二苯乙烯分子吡啶(深度贴图 )提供相应的它(- 15)14 腹主 动脉肠瘘或中等收入 高的效果图方案 2。所有的合成化合物进行表征红外光谱、1H 和 13C 核磁共振光谱及分辨率的质量光谱测定方法。2、 （ 1）生物活性在生物活性物的 14 和 15 结合腹主动脉肠瘘评估了体外细胞毒性试验进行了吗由 4 个人类肿瘤细胞株(HL - premyelocytic 白血病60 岁,肺癌的一个 549 -,HeL
11、a 颈癌,和宫颈癌SiHa 鳞状细胞癌), 利用 VP-16 和 5-FU,以供参考化合物。筛选程序是基于标准或 CCK-8method MTT34,这些实验的结果在表 1。（2）表 1 的阐述,结合物、14 和 15 腹主动脉肠瘘,一般的 5-FU,结合,DDPT 和 VP-16 在他们的对这四个细胞系细胞毒性。作为一个群体,这些化合物HL-60 细胞是最有效的方法,HeLa 最低的效力吗细胞,尽管效力不同的顺序在每个细胞线。 IC50 的价值的复合 14 d,它是最强大的共轭集团的化合物,是 0.023,0.56,0.83 和 0.76 毫米 HL-60,A -549 年,HeLa 和 S
12、iHa,分别。在表 1,我们也发现了近年来在 a-carbon 不同的氨基酸在这个班的化合物(14 aee)似乎有显著影响他们anti-proliferative 活动在体外检测。化合物 14 大规模表现出更强的活动对四人胃癌细胞株比 14 日和 14 个 b。此外,它与吞酸结合似乎更烈性比那些有 D -氨基酸替代物(14 e 与 14 f)。值得注意的是,它 incor - 15porated DDPT 与 5 -氟尿嘧啶- N1 的-ly 醋酸也针对这些 cytotoxities 展出高四个肿瘤细胞株。此结果和其他地方35 岁,36建议DDPT 将提高酯的抗肿瘤活性相比复合 DDPT 开始
13、的。这些结果也证实了这个假设在自由羟基 40DDPT 地位不是有利于35抗肿瘤活性。（3）据报道,结合诱导细胞凋亡及细胞周期阻滞G2 / M 期细胞在 HeLa16、17。它是否DDPT 5-FU 有类似的影响,肿瘤细胞的影响14 d 细胞周期进程 FACS 分析测定propidium iodide-stained A - 549 细胞37 。如图 2,治疗 0.5 毫米 14 d 导致时间的积累细胞在 G2 / M 期下降和药物G1 期细胞的人口。G2 / M 期逮捕最初经过 12 小时检测治疗;52.6%和 64.8%的 cellswere在 G2 / M 期为 12 h 14 d 暴露(
14、图 2 B)和 24 小时(图 2 C)分别比 15.6%在未处理的文化(图 2 A)。这些结果表明,14 d 干扰细胞扣押增殖细胞周期、诱导 G2 / M 逮捕A549 细胞,这 DDPT 物和 5-FU 有相似的影响细胞周期阻滞的结合与母体化合物16、17。（4）如上所述,诱导肿瘤细胞凋亡的结合时间的方式,然而,我们没有发现明显的凋亡在 14 d-treated FACS 分析一个 - 549 细胞。确认结合物的影响和 5-FU 的诱导凋亡上 ,一个- 549 的形态进行了 Hoechst 细胞使用染色。,如图 3 所示,消极的控制 (治疗)的细胞表现出优良的生长特性 24 小时后孵化(图
15、 3)。然而,一个到 549 个细胞治疗 14 d 唤起了 0.5 毫米典型的凋亡特征,如膜 blebbing、细胞收缩和剥离、和核缩合-甚至问技术(图 3 B)。类似的效果,观察到当细胞遭受到 0.5 毫米 PPT16。（5）天冬氨酸是 cysteinyl,还 proteinases 相合在天冬氨酸蛋白质基质残留。收到一个凋亡信号,还接受前体蛋白水解加工产生积极的活性。还在 11在人类的特征,caspase-3 和 7 个主要下-小溪还发挥重要作用效应,在降解大多数的关键细胞成分38细胞凋亡。决定是否参与 14 d-induced 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶凋亡、西方吸干了分析利用抗体认识和 c
16、aspase-7 裂形式的 caspase-339。我们发现的一种处理- 549 细胞 14 d - 0.5 毫米的毕业生增加的裂隙性两 caspase-3(图 4)caspase-7(图 4 B),以一种时间的方式。这些结果caspases-3 展示的介入或七 14 d-induced细胞凋亡的机制。四、总结综上所述,cytoxicity 测定大部分物增加了许多折叠活动相比父母任何一方或临床药物甙化合物结合,5-FU;此外,有前途的共轭 14 d 可以诱导细胞周期G2 / M 逮捕和凋亡 caspase-3 阶段采用活性7 在- 549 细胞。尽管有这些潜在的治疗的好处这种药物通过结合基团合
17、适的氨基酸仍不清楚,所得结果推广我们所相信的该方法也适用于其他抗肿瘤药物,和值得探讨潜在的作用这些和相似类型的化合物。我们目前的结果流更多灯光的潜力的共轭化合物来克服这些化疗耐药的出现频繁代理人。五、实验1、化学性质在 Kofler 熔点仪和确定眼睛。红外光谱测定 Nicolet 5 DX-FT-IR 上光谱仪样品之间放整齐 KBr 盘子。1HNMR13C 核磁共振光谱是记录在一个瓦里安 Mecury - 400 - BB谱作为内标 TMS,所有的化学变化价值观是报告为 d ppm。旋光度测定一个 Perkin 旋光仪埃尔 341 年 1 dm 细胞在 23 c 质量光谱是记录在一个 Bruk
18、er Daltonics APEXk49eVGZAB-HS(70 电子伏特)光谱仪的来源与应急电离,分别。所有反应进行了监测 chro 用薄层-matograph(TLC)在硅胶 GF254(0.25 毫米厚)。柱色谱(CC)进行(230 e400 硅胶 60网格、青岛海洋化工有限公司、中国)。类是分离自胆 emodi 药草 Podophyllum 墙于 var 胆,其他原料,庄智象购买和使用的商业没有进一步净化,除非另有说明。1.1、 10 的合成过程成为一个解决 5 -氟尿嘧啶(6.5 克,50 中和) 、钾氢氧化钠(5.6 克,100 年中和在水中添加 (40 毫升)解决氯乙酸(4.75
19、 克,50 中和)inwater(20 毫升)在 30 分钟内搅拌室温。pH 值的使命-提出调整混合物,并保持在 10 的 drop-by-drop添加 10%的氢氧化钾溶液。这然后 refluxed 混合 2 小时,冷静下来,acidified 2 对 pH 值添加集中的盐酸、水晶的10 人被孤立抽吸。填写了再结晶化解产品在饱和水钠 bicar -bonate 和 reprecipitated 浓郁的盐酸结果在白色的针。1.2、 11 的合成过程混合 2-N15-FU 醋酸(9.8 克,0.05 组分),p-nitro -苯酚(13.9 克,0.1 水解)和 DCC(10.3 克,0.05
20、水解) 了无水二甲基甲酰胺(100 毫升)为 4 h 在 0 C,然后搅了另一个12 h 室温。反应混合物被分散可供光波蒸发了,原油产品是值得进一步探讨的问题在 acetonitrile-ethanol 再结晶过程中产生复合 11 分。1.3、 12a-f 的一般合成过程p-Nitrophenyl 2-N15-fluorouracil-ylacetate 11(1.4 克,5 中和)被溶解在二甲基甲酰胺(10 毫升),然后解决含水 5%氢氧化钠(5 毫升)适当的 a-amino 酸(6 中和) 了themixture 搅拌 2 h 在 0 C,然后不断搅了 10 小时在室温条件下,pH 值的反
21、应混合物被阻挡在 8 e10。在真空环境下溶剂被移除从水渣结晶,化合物 12 腹主动脉肠瘘提供针状结晶。1.4、 14a-f 和 15 的一般制备Amixture 13(0.5 中和),10(或适当的 N-5-FU-acetic氨基酸 12 腹主动脉肠瘘)(0.5 中和) 和氮、N-dimethylaminopyridine(深度贴图,20 毫克) 都是在干燥的 12 种二氯甲烷(10 毫升)5 分钟室温下氩。氮、没有-dicyclohexylcarbodiimide DCC、104 毫克) 增加, 反应混合物就发动了 3 e40 h 和薄层色谱法监测。反应混合物在过滤和滤液风干。渣的分离复合
22、 14 和 15 负担腹主动脉肠瘘栏浓度-在 tography 硅胶与 dichloromethane-acetone 作为洗脱液。1.4.1、2、生物活性评估2.1、 细胞毒性检测细胞在 37 摄氏度孵化在 5% CO2 气氛。利用 MTTKit-8 和细胞计数(CCK-8)比色方法的使用生长抑素确定34。合成物和参考化合物 5 concentra 溶解在盐水-对其(0.005 e50 毫米)。为 HL-60 和 HeLa,细胞被镀96 孔板,然后暴露在 quadplex 好 48 小时。然后CCK-8 被添加到每个好。 4 小时后孵化,absor -在 l450 bance 以确定板的读者
23、。一 549 -和 SiHa,细胞在 96 -板包裹,允许归属24 小时,然后暴露于 48 小时。quadplex 以及媒体吸气,10 毫升 5 毫克/毫升 MTT 解决方案(稀释在无菌 PBS)在无血清培养基稀释被添加到每个好。经过四小时孵化,解决的办法是 10 分钟判读之下2000 每分钟转速。supernatantwasmixedwith DMSO 溶液的 150 毫升,thenwas在一个振荡器摇动。在确定了 l570 方式一个盘子的读者。IC50 值一个日志情节的确定控制与浓度的。2.2、细胞周期分析应用流式细胞仪等细胞周期分析中,我们使用了一个人类肺癌 -549 细胞株的生长在 R
24、PMI - 1640 增补有 10%(v / v)heat-inactivated 胎儿小牛血清、2 毫米谷酰胺、100 台/ 毫升青霉素、24 毫克/毫升庆大霉素和孵化为 37 个组织一个 humidified 大气 CO2 和 95% 5%的空气。未经处理的 ,药物治疗细胞(3 广生)采集和固定在-晚上在 70%的乙醇在 4 c 细胞进行清洗三次灯下,孵化为 1 h 和 1 毫克/ mL RNase 和 20 毫克/毫升propidium 化物在室温条件下,进行了研究, 分析了流动cytometer(库尔特 史诗 XL,美国)用前面的37。2.3、 检测凋亡的荧光显微镜Hoechst 凋亡
25、的检测组件(Beyotime、江苏、中国)用于检测细胞凋亡。简单地说,A549 细胞种植的大约 70 e80%融合滑梯上然后治疗吗用 14 d(0.5 毫米)或车辆,为 24 小时。随后,细胞固定的,洗两次沾 Hoechst PBS 和 33258染色溶液根据厂商的指示。染色体凝结和形态变化一个 fluorescencemicroscope 下观察图像系统( 奥林匹斯,日本东京)。2.4、蛋白质印迹分析分析法免疫印迹分析一个- 549 细胞(一日起施行细胞)暴露在复合 14 d流入管,然后洗灯下。细胞球lysesed 与 lyses 缓冲(50 毫米 TriseHCl,pH 值 7.5 - 10 毫米 EDTA,氯化钠 0.2 米,1.5 毫米 PMSF 和 1% SDS)。细胞 lysates 被煮熟10 分钟,判读和储存在细胞 lysates 含有 20 c10 e20 毫克蛋白质分离、转移到硝酸纤维素过滤器。这个污渍被孵化与相应的抗体与发达(39)。
