1、第39卷第6期 浙江工业大学学报 V0139 No6201 1年12月 JOURNAL OF ZHEJIANG UNIVERSITY OF TECHNOLOGY Dec201 1交联透明质酸体外降解和细胞毒性研究冯 海1。黄鑫1。苏李1，张惠成2。胡勇平2(1浙江工业大学药学院，浙江杭州31003212杭州市第一人民医院，浙江杭州310006)摘要：研究交联透明质酸体外降解特性和细胞毒性，为评价其作为医用生物材料的安全性提供依据通过化学交联法制备交联HA，采用MTT法测定材料的细胞毒性并研究其降解特性测得交联HA的溶胀度为6067O12；在pH=70的生理盐水中，该材料在37，60 d内凝胶失
2、重率为138 oA，干物质质量保持率为501；其体外细胞毒性与阴性对照物(HDPE)接近结果显示交联HA的生物安全性较好，在进一步验证后，可作为植入性生物医学材料使用关键词：交联透明质酸；体外降解；细胞毒性；生物材料中图分类号：X1312 文献标识码：A 文章编号：10064303(2011)060630-05Research Oil degradation and cytotoxicity of cross-linked hyaluronic acid in vitroFENG Hail，HUANG Xinl，SU Lil，ZHANG Huichen92，HU Yongpin92(1Coll
3、ege of PharmacyZhejiang University of Technology，Hangzhou 310032，China2Hangzhou First Peoples Hospital，Hangzhou 310006，China)Abstract：In order to study the degradation characteristics and cytotoxicity of crosslinkedhyaluronic acid in vitro，crosslinked HA was prepared by chemical methodIts degradatio
4、ncharacteristics in vitro were studied and its cytotoxicity was determined bv MTT methodTheswelling degree of cross-linked HA was about 6067012l at pH=70，37，after tWOmonths testing。the crosslinked HA gel decreased by 138，and the dried crosslinked HAremained 501；the cytotoxicity of crosslinked HA was
5、 similar with that of HDPECrosslinked HA showed good biological safety and could be used as implantable biomedicalmaterials by performing some further testingKey words：crosslinked hyaluronic acid；degradation in vitro；cytotoxicity；biomaterials透明质酸(Hyaluronic acid，以下称HA)是一种独特的线性大分子粘多糖，由葡萄糖醛酸和N一乙酰氨基葡萄糖
6、的双糖单位反复交替连接而成，与其它天然粘多糖不同，HA分子内不含硫酸基团，也不与蛋白质共价结合，不存在易引发抗原反应的基团近年来，HA作为一种高相容性可吸收的生物材料，广泛应用于临床医学各个领域，如作为眼科前房填充剂，注入后可维持一定的前房深度，不仅便于手术操作，还有保护角膜内皮细胞及眼内组织，减少手术并发症，促进伤口愈合的作用经化学修饰后得到交联HA作为一种非水溶性，可注射，可移植的HA衍生物，具有良好的生物相容性及具有较好的流变性能，能很好地弥补天然HA在组织中易扩散和降解，体内存留时间短等缺点1通过控制交联强度可收稿日期：20100707基金项目：浙江省科技计划项目(2008C23058
7、)#浙江省重大科技专项(2007C12070)作者简介：冯海(1973一)男，浙江杭州人，副教授，博士，研究方向为药物新剂型与新技术，Email：fenghai289289163coln万方数据第6期 冯海，等：交联透明质酸体外降解和细胞毒性研究 631得到具有较高机械强度和可以调控降解速度的交联HA产品，使其在泌尿科，皮肤科及美容外科中用作软组织填充的生物材料2。3交联HA在国内研究较少，笔者采用1，4一丁二醇二缩水甘油醚(BUDGE)作为交联剂，连接HA的羟基形成空间网状结构，可作为新型医疗器械用生物材料为判定其是否满足国家三类医疗器械所必须满足的医用要求，我们参照GBT16886国家标准
8、43对本实验室自制的交联透明质酸凝胶进行初步的生物安全性评价，结果基本符合医用材料的要求1 实验部分11仪器和材料111仪 器pHS-3000实验室酸度计(成都全速科技有限公司)；真空干燥箱DZF一6020MBE(福州精科仪器仪表有限公司)；台式高速离心机TGL-16G(上海安亭科学仪器厂)；紫外可见分光光度计GOLDS54GOLDS53(上海棱光技术有限公司)；电子分析天平APll0S(美国0HAUS)；THZC恒温振荡器(江苏太仓市实验设备厂)；垂直流超净台(ESC0，SCV一4A1)；C02培养箱(Thermo Electron Corporation，Fonma 3111)；倒置显微镜
9、(Nikon Eclipse，型号TSl00一FDHl)；酶标仪(Molecular Devices，Spectramax M2e)；离心机(Heraeus，LDZ52)112试 剂HA(山东福瑞达生物化工有限公司)；1，4一丁二醇二缩水甘油醚(BUDGE，AR，美国sigma公司)；磷酸氢二钠(AR，杭州长征化工厂)；对羟基苯甲酸乙酯(AR，金城试剂有限公司)；氯化钠(AR，浙江中星化工试剂有限公司)；无水乙醇(AR，安徽安特生物化学有限公司)；去离子水(实验室自制)；氢氧化钠(AR，萧山化学试剂厂)；RPMI 1640培养液，小牛血清，025胰蛋白酶，PBS，DMSO(上海吉诺医药生物技术
10、有限公司)；MTT(Sigma)；透析袋(截留分子量14 000)113细胞株小鼠成纤维细胞L一929(购自美国ATCC)12实验方法121化学法制备交联HA用09NaCl溶液95 mL加入HA 5 g配制浓度为5的HA钠溶液100 mL，按m(HA)：m(BUDGE)=1：1将交联剂BUDGE和5HA混合均匀，搅拌3 min，加入01 molL NaOH溶液1 mL，交联反应24 h24 h后将交联HA置于pH一686的PBS溶液中终止反应，用去离子水反复冲洗去除残留在表面的BUDGE，低温干燥5 h后再加入无水乙醇50 mL以去除其内部残留交联剂，粉碎过60目筛得到细粒状交联HA122 交
11、联HA溶胀度测定本实验所得交联HA为网状交联高分子材料，不溶于水和有机溶剂，无法测定粘度和分子量交联HA作为生物医用高分子聚合物，根据GBT16886国家标准可采用测定其溶胀度来计算交联密度作为材料的表征方法溶胀度测定一般分为体积法与质量法5，笔者采用质量法方法：精密称取一定量已达到溶胀平衡的交联HA，记为湿重，装入透析袋中，用无水乙醇脱水4 h，60真空干燥到恒重，扣去袋重即为交联HA干重其湿重与干重的比例即为溶胀度以实验天数为横坐标，以溶胀度为纵坐标绘制溶胀度一时间变化曲线123 交联HA体外降解实验精密称取一定量已达到溶胀平衡的交联HA，按m(交联HA)：仇(降解溶液)=1：200放入恒
12、温振荡器中，设置(37土1)，振荡频率100次mirL降解溶液是由质量分数为09NaCl，004对羟基苯甲酸乙酯的水溶液构成，并用磷酸氢二钠调至pH=70按照试验期进行取样，用37生理盐水透析2 h以置换袋中的分析液，无水乙醇脱水4 h，60真空干燥到恒重，测定质量保持率：质量保持率=竺X100，l式中：W。=降解前的干重；硼：一降解后的干重124 交联HA体外细胞毒性测试根据GBT16886国家标准，交联HA作为国家三类医疗器械需进行体外细胞毒性测试，并按标准要求采用高密度聚乙烯(HDPE)作为阴性对照材料，天然乳胶作为阳性对照材料(1)浸提液制备分别将交联HA，HDPE，天然乳胶与RPMI
13、l 640培养液按02 gmL混合，置于37，5C02孵箱中浸提72 h，022“m微孔滤膜过滤除菌，即得浸提液4万方数据浙江工业大学学报 第39卷(2)L929细胞培养L929细胞，按5104个孔接种于96孔培养板，以含10新生牛血清的RPMI 1640为培养液，置于37孵箱中培养(5CO：)待细胞增植至孔底面积6080时换液，每孔加入与原培养液等体积的含10新生牛血清浸提液继续置于37孵箱中培养48 h(3)MTT法测定细胞活性实验共设空白对照组，阴性对照组，阳性对照组与实验组，每组设8个复孔培养板每孑L加入MTT溶液(5 mgmL)20扯L，37继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养
14、上清液每孔加入200肛LDMS0，吹打均匀，用酶标仪在570 nm测其OD值。引(4)细胞毒性判定根据美国药典29版6，计算细胞相对增生率RGR，按表1标准判断结果RGR-器器箍00衰1 美国药典中细胞相对增殖率与细胞毒性分级关系1Table 1 Relationship between cell relative proliferation rateand cytotoxcity grade in USPRGR 细胞毒性分级100805030O注：1)根据美国药典，测试细胞与样品浸提液共同孵育48 h后，2级反应以内的测试材料生物安全性均符合要求72结果与分析21交联HA溶胀度测定交联HA在
15、降解溶液会吸水膨胀形成凝胶，笔者将凝胶质量记为湿重，以溶胀度作为材料交联密度表征方法如表2所示，将交联HA置于60降解溶液中溶胀24 h，3个样品每个平行测定三次(，z=3)表2不同交联HA样品60溶胀度Table 2 Different crosslinked HA samplesswelling degreesunder 60经测量，3个交联HA样品的平均溶胀度为6067士012，测定结果较为接近(p005)，标准差较小，表明交联工艺稳定性较好22交联HA体外降解实验221 37条件下交联HA凝胶失重率测定精密称取020 g份的交联HA样品(咒=6)放入恒温振荡器中，设置(37土1)，振荡
16、频率100次疵n按照试验期d1，d2，d5，d6，d7，d8，d11，d12，d30，d60取样交联HA凝胶主要成分为水，凝胶会逐步降解而使质量降低，因此笔者首先考察交联HA凝胶在37条件下，60 d内自然降解所致的质量变化如图l所示，交联HA凝胶在60 d降解期内，其质量在前5 d稍有增大，此后平缓减小这主要是因为交联HA本身具有很大的吸水性，交联聚合物在水中不能溶解，但能产生一定程度的溶胀，溶胀程度取决于聚合物的交联度溶剂分子进入聚合物交联成的网络时，将引起三维分子网的伸展而使聚合物交联体系体积膨胀；同时聚合物交联网的伸展，则将产生交联网中交联点间高分子链构象熵的降低，从而使交联网产生弹性
17、收缩力，这种收缩力的大小取决于交联聚合物中两交联点间高分子链段的平均分子量值当溶剂的溶胀力和交联链段的收缩力相平衡时，体系达到了溶胀平衡状态，溶胀体的体积不再变化凹。9其后随着交联HA分子的逐步降解，材料部分破碎，交联物的强度逐渐降低，凝胶质量开始出现下降经测算，第60 d时交联HA凝胶失重率约为13814OO12OO1000谪800皤6004002000OO图1 60 d内交联HA凝胶体外降解Fig1 Weight changes of crosslinked HA gel in 60 days222 37条件下交联HA质量保持率，溶胀度随时间变化的测定精密称取02 g份的交联HA样品共15
18、份放人恒温振荡器中，设置(371)，振荡频率100次rain按照试验期d0，d5，d11，d30，d60取样，每次称取样品3个(咒一3)，测定其质量保持率与溶胀度变化溶胀度与聚合物的交联密度呈反比关系，溶胀度越大，万方数据第6期 冯海，等：交联透明质酸体外降解和细胞毒性研究交联密度越低，因此通过溶胀度变化可间接反映交联HA的交联密度变化以交联HA质量保持率为纵坐标，降解时间为横坐标，进行线性回归，得回归方程为v=一0797 9x+9666，R一0990 7结果表明：交联HA在60 d内降解呈现零级动力学过程，线性关系良好，60 d时干物质质量保持率为501，与其他文献“”中的交联HA相比，其降
19、解速率大大降低，见图2100粪140001200010000型曲00嚣60004020 oo0图3交联HA溶胀度一时间变化Fig3 Swelling degrees of crosslinked HA in 60 days23体外细胞毒性研究采用MTT法其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中二甲基亚砜(DMSO)能溶解甲瓒，用酶标仪在570 nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量在一定范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比如图4所示，交联HA组与HDPE组相比，p口05，即无显著性差异；与天然乳胶组相比
20、，户0001，有显著性差异经计算，空白对照组，HDPE组，交联HA组，天然乳胶组细胞存活率见表3。I斛网垦叫图黼雪l隧鬻翻l-删童萝l 2 3 4组别卜空白对照组；2-HDPE组13-交联HA组14-天然乳腔组图4不同实验材料对细胞活性的影响Fig4 Effects on cell activity by difterent materials表3不同实验材料细胞毒性分级Table 3 CytotoJdcity grade for different materials根据表3，交联HA细胞毒性为1级，符合美国药典将其作为生物材料的要求与阴性对照材料HDPE类似根据国家三类医疗器械标准，可通过
21、遗传毒性，致癌性和生殖毒性试验等生物安全性评价来继续验证交联HA作为植入性生物医学材料使用3结论采用化学交联法制得的交联HA具有良好的生物相容性，在两个月的37体外降解期中，凝胶失重率为l 38，干物质质量保持率为501，较其他文献报道的交联HA降解速率较慢其细胞毒性等级为1级，符合美国药典作为生物材料的要求，降解产物与普通透明质酸降解产物类似，进一步按照国家标准GBT16886进行其他相关生物安全性评价后可作望做为国家三类医疗器械使用除此之外，它可在药物缓释媒介，肿瘤药物靶向载体等o”方面发挥重要作用，具有广阔的前景万方数据634 浙江工业大学学报 第39卷参考文献：1 AMELIA G，S
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