1、心外科专业优秀论文 骨髓间充质干细胞向动静脉内皮细胞的诱导及其机制的基础研究关键词：骨髓间充质干细胞 内皮细胞 动脉标志物 静脉标志物摘要：背景： 骨髓基质系统中的骨髓间充质干细胞是一种具有多向分化潜能的干细胞，它可以向多种结缔组织以及部分来源于外胚层的组织分化，形成骨、软骨、骨骼肌、腱、韧带、真皮、脂肪、骨髓基质和神经。骨髓间充质干细胞具有黏附性，成纤维样和克隆样生长的特性，而且表达特定的细胞表型。因为骨髓间充质干细胞在体外具有高度扩增能力，能够分化为多系细胞，而且具有来源充足、细胞培养成活率高、无免疫排异等优点，其已经成为心脏病细胞移植治疗中最具潜力的种子细胞。最近研究发现人骨髓来源的间充
2、质干细胞在体外能够诱导成内皮样细胞。脐血和胎膜来源的间充质干细胞在体外和体内都能分化为内皮细胞。然而，骨髓来源的间充质干细胞分化的内皮细胞的动静脉的特异性和其中的分子机制尚不清楚。 研究目的： 本研究旨在阐明在体外和体内实验中 VEGF 诱导人骨髓间充质干细胞分化的内皮样细胞的动静脉命运。 Notch 信号通路在 VEGF 诱导人骨髓间充质干细胞分化的内皮样细胞的动静脉命运过程的作用。 研究方法： 阜外心血管病医院伦理委员会批准这个研究协议，选择年龄 6 个月到 12 岁的心脏病患儿心脏开胸手术时从胸骨收取骨髓血，所有参与者的父母都签订书面赞同协议，研究协议遵守 1975 年赫尔新基宣言。 一
3、、骨髓间充质干细胞的分离和鉴定 以 Histopaque 密度梯度离心法从人的胸骨骨髓血中分离人骨髓间充质干细胞，PBS 洗两次后，细胞种植在 T75cm2 塑料培养瓶中，培养液是含 10胎牛血清的 IMDM，培养液中加入青霉素（100g/mL）和链霉素（100 mg/mL） ，在含 5CO2，95湿度的细胞培养箱。3 天培养后，细胞换培养液，黏附的细胞继续生长，未贴壁的细胞抛弃。在1014 天培养后，黏附的细胞呈集落式生长，可达到 70-80的融合。025胰蛋白酶消化收集细胞，以 104 个细胞/cm2 传代。所有实验均采用第一代细胞。生长曲线的制作。 骨髓间充质干细胞表面抗原检测。胰蛋白酶
4、消化收集细胞，PBS 洗两次，洗去残留培养液，制成 106 个/ml 的细胞悬液 100l。加入相应抗体 20l，室温避光反应 30min。1800rpm，10min 室温离心，弃上清。加入500l PBS 重悬细胞，流式检测 CD14-PE，CD34-PE，CD45-PE，CD90-PE，CD105-PE，和 CD73-FITC。鼠 IgG1-FITC 和 IgG1-PE 作为同型对照。 骨髓间充质干细胞多向分化潜能测定。 干细胞成脂肪细胞诱导。第一代骨髓间充质干细胞达 60-70融合后，加成脂肪细胞诱导液。每 3 天换液一次，继续加成脂肪细胞诱导液。两周后进行苏丹染色：PBS 冲洗细胞两次
5、，以沈去残留的培养液。加入苏丹染料，37静置 30min。PBS 洗去染料，光学显微镜下观察细胞中红色的脂肪颗粒。 干细胞成骨细胞诱导。第一代骨髓间充质干细胞达 60-70融合后，加成骨细胞诱导液。每 3 天换液一次，继续加成骨细胞诱导液。两周后进行茜素红染色：PBS 冲洗细胞两次，以洗去残留的培养液。加入茜素红染料，室温静置 5min。PBS 洗去染料，光学显微镜下观察红色钙沉淀。 MSC 向内皮细胞分化。 以 2104cm2 密度种植细胞，IMDM 培养基内加入 50 ng/mL VEGF。 细胞免疫组化检测 vWF，KDR，Flt-1，Tie-1，Tie-2。 实时荧光定量 PCR 检测
6、 vWF。 MSC 向动静脉内皮的诱导。 以2104cm2 密度种植细胞，IMDM 培养基内加入 50 ng/mL，和 100 ng/mLVEGF。 细胞荧光免疫组化检测 Ephrin-B2，和 EphB4。二抗用 FITC 或 TRITC 标记。DAPI 标记细胞核。 实时荧光定量检测不同浓度诱导的内皮细胞的内皮标致物 KDR，Flt-1，Tie-2，vWF，动脉内皮标致物 Ephrin-B2，Dll4 和 Notch4，静脉内皮标志物 EphB4 和 COUP-TFII。 内皮功能实验。 Dil-ac-LDL 吞噬实验。分化的 hMSC 种植在 T25 c培养瓶，培养基加入 10g/mL
7、Dil-ac-LDL，37下孵育 4 小时后，细胞用不含 Dil-ac-LDL 的培养基洗 3 次，然后在荧光显微镜下检查。 体外成血管实验。用成血管试剂盒（ECM625）分析微管状结构的形成。将 ECM 胶液和稀释液在 0水浴箱内冻融，成液体状，每 900微升 ECM 胶液加入 100 微升稀释液，混均，将上述溶液加入 96 孔板，每孔 50微升，37 摄氏度孵育 1 小时成胶。消化分化的 MSC，并重新悬浮于 IMDM 培养液包含 50 ng/mL，VEGF，调整细胞数目 5103ml，将细胞接种于 ECM 胶上，孵育4-24 小时，在倒置显微镜下观察。 体内成血管实验。取 10 周龄的雄
8、性裸鼠，1戊巴比妥腹腔注射麻醉后，在皮下分别注射 300 微升 Matrigel 胶包含 100 ng/mL VEGF 和 MSCs 或者 100 ng/mLVEGF 但无 MSCs 细胞。MSCs 用 DAPI 标记细胞核。2 周后，处死裸鼠，取出 Matrigel 胶用 OCT 包埋。冰冻切片后行vWF，ephrinB2，EphB4 和抗鼠 CD31 的免疫荧光染色。在荧光显微镜下检查。 Notch 通路作用研究。 抑制剂组：浓度 1M 的 -分泌酶抑制剂（L-685，458）加入到 IMDM 培养基内。hMSC 加 VEGF 组。单纯 hMSC 组。 实时荧光定量 PCR。检测各组 He
9、y2，Dll4，ephrinB2，ephrinB1，COUP-TP和 EphB4的表达。 结果： 培养 7 天以后可见细胞呈集落式生长，集落中央细胞较为密集。细胞为成纤维细胞状，其间夹杂圆形的细胞。10-14 天以后细胞可达到 70-80的融合。生长曲线显示 1-7 天为潜伏期，10 天后进入平台生长期。表面抗原检测 CD14，CD34，CD45 阴性，超过 90的细胞表达CD90，CD105，CD73。骨髓间充质干细胞在一定的诱导条件下能分化为脂肪样细胞和骨样细胞类型，具有多向分化的潜能。 50 ng/mL VEGF 诱导 MSC 两周后细胞免疫组化染色结果 Flt-1 阳性率 794-4，
10、KDR 阳性率 875，Tie-1 阳性率 854-8，Tie-2 阳性率 836，vWF 阳性率 654。实时荧光定量 PCR 显示 vWF 在 2 周和 3 周时显著升高。 100 ng/mL VEGF 诱导 MSC和 50 ng/mL VEGF 诱导 MSC 组比较，实时荧光定量 PCR 显示 100 ng/mL VEGF组 KDR，Flt-1，Tie-1，Tie-2，vWF 较 50ng/mL VEGF 组升高，但差异没有显著性。荧光双染色显示 50 ng/mLVEGF 组 MSC 诱导的 ECs 动脉标志物 ephrinB2 阳性率 1142，静脉标志物 EphB4 阳性率 654，
11、100 ng/mL VEGF 组动脉标志物 665，静脉标志物 EphB4 阳性率 213。在诱导 14 天后提取 mRNA，用实时荧光定量 PCR 测定显示 100 ng/mL VEGF 组动脉标志物 Ephrin-B2，Dll4，和 Notch4 显著升高（Plt;001） ，静脉标志物 COUP-TF和EphB4 都下调，但只有 COUP-TF有显著差异性（Plt;001） 。 体外实验中 50 ng/mLVEGF 组诱导 14 天后能够摄取 Dil-ac-LDL973，并且在Matrigel 形成管状的网络结构。体内试验中，Matrigel 胶含 MSC 组在 14 天后可以观察到许多
12、新生的血管，对照组则几乎没有。DAPI 标记的 MSC 显示 MSC 持续存在 Matrigel 栓内，免疫组化显示多数植入的细胞表达了 vWF，ephrinB2和 EphB4。用抗鼠的 CD31 染色证实 Matrigel 栓内的血管是鼠原性的。细胞组和非细胞植入组比较，血管密度分别为 1315 和 4611 每 025mm2，而且 DAPI 标记的 MSC 围绕在血管管腔周围，没有足够证据显示 MSC 分化的 EC掺入了新生的血管，因此 MSC 诱导的 ECs 有助于宿主血管的新生但没有形成新生血管。 抑制 Notch 信号后，用实时荧光定量 PCR 检测动脉和静脉标志物显示，动脉标志物
13、Hey2，Dll4，和 ephrinB2 显著降低（Plt;001） ，但ephrinB1 无显著差异性（Pgt;005） ，同时静脉标志物 COUP-TP显著增加（Plt;001） ，EphB4 无显著差异性（Pgt;005） 。 结论及意义： VEGF 能诱导 MSC 分化为动脉和静脉内皮细胞，这种作用存在剂量依赖性。 高浓度的 VEGF 有助于 MSC 诱导的内皮细胞表达动脉标志物，低浓度的VEGF 则有助于 MSC 诱导的内皮细胞表达静脉标志物。 抑制 Notch 通路后，VEGF 诱导的动脉化分化被大部分阻止，转向分化为静脉内皮细胞。正文内容背景： 骨髓基质系统中的骨髓间充质干细胞是
14、一种具有多向分化潜能的干细胞，它可以向多种结缔组织以及部分来源于外胚层的组织分化，形成骨、软骨、骨骼肌、腱、韧带、真皮、脂肪、骨髓基质和神经。骨髓间充质干细胞具有黏附性，成纤维样和克隆样生长的特性，而且表达特定的细胞表型。因为骨髓间充质干细胞在体外具有高度扩增能力，能够分化为多系细胞，而且具有来源充足、细胞培养成活率高、无免疫排异等优点，其已经成为心脏病细胞移植治疗中最具潜力的种子细胞。最近研究发现人骨髓来源的间充质干细胞在体外能够诱导成内皮样细胞。脐血和胎膜来源的间充质干细胞在体外和体内都能分化为内皮细胞。然而，骨髓来源的间充质干细胞分化的内皮细胞的动静脉的特异性和其中的分子机制尚不清楚。
15、研究目的： 本研究旨在阐明在体外和体内实验中 VEGF 诱导人骨髓间充质干细胞分化的内皮样细胞的动静脉命运。 Notch 信号通路在 VEGF 诱导人骨髓间充质干细胞分化的内皮样细胞的动静脉命运过程的作用。 研究方法： 阜外心血管病医院伦理委员会批准这个研究协议，选择年龄 6 个月到 12 岁的心脏病患儿心脏开胸手术时从胸骨收取骨髓血，所有参与者的父母都签订书面赞同协议，研究协议遵守 1975 年赫尔新基宣言。 一、骨髓间充质干细胞的分离和鉴定 以 Histopaque 密度梯度离心法从人的胸骨骨髓血中分离人骨髓间充质干细胞，PBS 洗两次后，细胞种植在 T75cm2 塑料培养瓶中，培养液是含
16、 10胎牛血清的 IMDM，培养液中加入青霉素（100g/mL）和链霉素（100 mg/mL） ，在含 5CO2，95湿度的细胞培养箱。3 天培养后，细胞换培养液，黏附的细胞继续生长，未贴壁的细胞抛弃。在1014 天培养后，黏附的细胞呈集落式生长，可达到 70-80的融合。025胰蛋白酶消化收集细胞，以 104 个细胞/cm2 传代。所有实验均采用第一代细胞。生长曲线的制作。 骨髓间充质干细胞表面抗原检测。胰蛋白酶消化收集细胞，PBS 洗两次，洗去残留培养液，制成 106 个/ml 的细胞悬液 100l。加入相应抗体 20l，室温避光反应 30min。1800rpm，10min 室温离心，弃上
17、清。加入500l PBS 重悬细胞，流式检测 CD14-PE，CD34-PE，CD45-PE，CD90-PE，CD105-PE，和 CD73-FITC。鼠 IgG1-FITC 和 IgG1-PE 作为同型对照。 骨髓间充质干细胞多向分化潜能测定。 干细胞成脂肪细胞诱导。第一代骨髓间充质干细胞达 60-70融合后，加成脂肪细胞诱导液。每 3 天换液一次，继续加成脂肪细胞诱导液。两周后进行苏丹染色：PBS 冲洗细胞两次，以沈去残留的培养液。加入苏丹染料，37静置 30min。PBS 洗去染料，光学显微镜下观察细胞中红色的脂肪颗粒。 干细胞成骨细胞诱导。第一代骨髓间充质干细胞达 60-70融合后，加
18、成骨细胞诱导液。每 3 天换液一次，继续加成骨细胞诱导液。两周后进行茜素红染色：PBS 冲洗细胞两次，以洗去残留的培养液。加入茜素红染料，室温静置 5min。PBS 洗去染料，光学显微镜下观察红色钙沉淀。 MSC 向内皮细胞分化。 以 2104cm2 密度种植细胞，IMDM 培养基内加入 50 ng/mL VEGF。 细胞免疫组化检测 vWF，KDR，Flt-1，Tie-1，Tie-2。 实时荧光定量 PCR 检测 vWF。 MSC 向动静脉内皮的诱导。 以2104cm2 密度种植细胞，IMDM 培养基内加入 50 ng/mL，和 100 ng/mLVEGF。 细胞荧光免疫组化检测 Ephri
19、n-B2，和 EphB4。二抗用 FITC 或 TRITC 标记。DAPI 标记细胞核。 实时荧光定量检测不同浓度诱导的内皮细胞的内皮标致物 KDR，Flt-1，Tie-2，vWF，动脉内皮标致物 Ephrin-B2，Dll4 和 Notch4，静脉内皮标志物 EphB4 和 COUP-TFII。 内皮功能实验。 Dil-ac-LDL 吞噬实验。分化的 hMSC 种植在 T25 c培养瓶，培养基加入 10g/mL Dil-ac-LDL，37下孵育 4 小时后，细胞用不含 Dil-ac-LDL 的培养基洗 3 次，然后在荧光显微镜下检查。 体外成血管实验。用成血管试剂盒（ECM625）分析微管状
20、结构的形成。将 ECM 胶液和稀释液在 0水浴箱内冻融，成液体状，每 900微升 ECM 胶液加入 100 微升稀释液，混均，将上述溶液加入 96 孔板，每孔 50微升，37 摄氏度孵育 1 小时成胶。消化分化的 MSC，并重新悬浮于 IMDM 培养液包含 50 ng/mL，VEGF，调整细胞数目 5103ml，将细胞接种于 ECM 胶上，孵育4-24 小时，在倒置显微镜下观察。 体内成血管实验。取 10 周龄的雄性裸鼠，1戊巴比妥腹腔注射麻醉后，在皮下分别注射 300 微升 Matrigel 胶包含 100 ng/mL VEGF 和 MSCs 或者 100 ng/mLVEGF 但无 MSCs
21、 细胞。MSCs 用 DAPI 标记细胞核。2 周后，处死裸鼠，取出 Matrigel 胶用 OCT 包埋。冰冻切片后行vWF，ephrinB2，EphB4 和抗鼠 CD31 的免疫荧光染色。在荧光显微镜下检查。 Notch 通路作用研究。 抑制剂组：浓度 1M 的 -分泌酶抑制剂（L-685，458）加入到 IMDM 培养基内。hMSC 加 VEGF 组。单纯 hMSC 组。 实时荧光定量 PCR。检测各组 Hey2，Dll4，ephrinB2，ephrinB1，COUP-TP和 EphB4的表达。 结果： 培养 7 天以后可见细胞呈集落式生长，集落中央细胞较为密集。细胞为成纤维细胞状，其间
22、夹杂圆形的细胞。10-14 天以后细胞可达到 70-80的融合。生长曲线显示 1-7 天为潜伏期，10 天后进入平台生长期。表面抗原检测 CD14，CD34，CD45 阴性，超过 90的细胞表达CD90，CD105，CD73。骨髓间充质干细胞在一定的诱导条件下能分化为脂肪样细胞和骨样细胞类型，具有多向分化的潜能。 50 ng/mL VEGF 诱导 MSC 两周后细胞免疫组化染色结果 Flt-1 阳性率 794-4，KDR 阳性率 875，Tie-1 阳性率 854-8，Tie-2 阳性率 836，vWF 阳性率 654。实时荧光定量 PCR 显示 vWF 在 2 周和 3 周时显著升高。 10
23、0 ng/mL VEGF 诱导 MSC和 50 ng/mL VEGF 诱导 MSC 组比较，实时荧光定量 PCR 显示 100 ng/mL VEGF组 KDR，Flt-1，Tie-1，Tie-2，vWF 较 50ng/mL VEGF 组升高，但差异没有显著性。荧光双染色显示 50 ng/mLVEGF 组 MSC 诱导的 ECs 动脉标志物 ephrinB2 阳性率 1142，静脉标志物 EphB4 阳性率 654，100 ng/mL VEGF 组动脉标志物 665，静脉标志物 EphB4 阳性率 213。在诱导 14 天后提取 mRNA，用实时荧光定量 PCR 测定显示 100 ng/mL V
24、EGF 组动脉标志物 Ephrin-B2，Dll4，和 Notch4 显著升高（Plt;001） ，静脉标志物 COUP-TF和EphB4 都下调，但只有 COUP-TF有显著差异性（Plt;001） 。 体外实验中 50 ng/mLVEGF 组诱导 14 天后能够摄取 Dil-ac-LDL973，并且在Matrigel 形成管状的网络结构。体内试验中，Matrigel 胶含 MSC 组在 14 天后可以观察到许多新生的血管，对照组则几乎没有。DAPI 标记的 MSC 显示 MSC 持续存在 Matrigel 栓内，免疫组化显示多数植入的细胞表达了 vWF，ephrinB2和 EphB4。用抗
25、鼠的 CD31 染色证实 Matrigel 栓内的血管是鼠原性的。细胞组和非细胞植入组比较，血管密度分别为 1315 和 4611 每 025mm2，而且 DAPI 标记的 MSC 围绕在血管管腔周围，没有足够证据显示 MSC 分化的 EC掺入了新生的血管，因此 MSC 诱导的 ECs 有助于宿主血管的新生但没有形成新生血管。 抑制 Notch 信号后，用实时荧光定量 PCR 检测动脉和静脉标志物显示，动脉标志物 Hey2，Dll4，和 ephrinB2 显著降低（Plt;001） ，但ephrinB1 无显著差异性（Pgt;005） ，同时静脉标志物 COUP-TP显著增加（Plt;001）
26、 ，EphB4 无显著差异性（Pgt;005） 。 结论及意义： VEGF 能诱导 MSC 分化为动脉和静脉内皮细胞，这种作用存在剂量依赖性。 高浓度的 VEGF 有助于 MSC 诱导的内皮细胞表达动脉标志物，低浓度的VEGF 则有助于 MSC 诱导的内皮细胞表达静脉标志物。 抑制 Notch 通路后，VEGF 诱导的动脉化分化被大部分阻止，转向分化为静脉内皮细胞。背景： 骨髓基质系统中的骨髓间充质干细胞是一种具有多向分化潜能的干细胞，它可以向多种结缔组织以及部分来源于外胚层的组织分化，形成骨、软骨、骨骼肌、腱、韧带、真皮、脂肪、骨髓基质和神经。骨髓间充质干细胞具有黏附性，成纤维样和克隆样生长
27、的特性，而且表达特定的细胞表型。因为骨髓间充质干细胞在体外具有高度扩增能力，能够分化为多系细胞，而且具有来源充足、细胞培养成活率高、无免疫排异等优点，其已经成为心脏病细胞移植治疗中最具潜力的种子细胞。最近研究发现人骨髓来源的间充质干细胞在体外能够诱导成内皮样细胞。脐血和胎膜来源的间充质干细胞在体外和体内都能分化为内皮细胞。然而，骨髓来源的间充质干细胞分化的内皮细胞的动静脉的特异性和其中的分子机制尚不清楚。 研究目的： 本研究旨在阐明在体外和体内实验中 VEGF 诱导人骨髓间充质干细胞分化的内皮样细胞的动静脉命运。 Notch 信号通路在 VEGF 诱导人骨髓间充质干细胞分化的内皮样细胞的动静脉
28、命运过程的作用。 研究方法： 阜外心血管病医院伦理委员会批准这个研究协议，选择年龄 6 个月到特别提醒 ：正文内容由 PDF 文件转码生成，如您电脑未有相应转换码，则无法显示正文内容，请您下载相应软件，下载地址为 http:/ 。如还不能显示，可以联系我 q q 1627550258 ，提供原格式文档。我们还可提供代笔服务，价格优惠，服务周到，包您通过。“垐垯櫃 换烫梯葺铑?endstreamendobj2x 滌甸?*U 躆 跦?l, 墀 VGi?o 嫅#4K 錶 c#x 刔 彟 2Z 皙笜?D 剧珞 H 鏋 Kx 時 k,褝仆? 稀?i 攸闥-) 荮vJ 釔絓|?殢 D 蘰厣?籶(柶胊?07
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