1、生态学专业毕业论文 精品论文 哈维氏弧菌 VHH 溶血素作用机理的研究关键词：哈维氏弧菌 水产养殖业 海水养殖 病原弧菌 VHH 溶血素 磷脂酶活性摘要：随着水产养殖业近年来的迅速发展，海水养殖动物的细菌性病害造成了巨大的经济损失。由弧菌属细菌(Vibrio spp)引起的弧菌病(Vibriosis)是在世界各地鱼、虾、贝类等海水养殖动物中普遍流行、危害最大的细菌性疾病之一。弧菌是海洋环境中常见细菌类群之一，广泛分布在近岸及河口海水、海洋生物的体表与肠道中，是海水和许多海洋生物的正常菌群。在已知的弧菌中，约 20 种是海水养殖动物的病原菌。哈维氏弧菌作为一种重要的海水养殖动物病原弧菌，其危害日
2、益显现。哈维氏弧菌的致病机理还不清楚。 在哈维氏弧菌可能的毒力因子中，VHH 溶血素-一种副溶血弧菌 TLH 类的溶血素，被认为与哈维氏弧菌对鱼的致病性密切相关。本研究以气相色谱技术检测哈维氏弧菌VHH 溶血素磷脂酶水解磷脂酰胆碱的产物，确定了其磷脂酶活性的类型：VHH 既有磷脂酶 A1 活性，又有磷脂酶 A2 活性，是一种磷脂酶 B。对重组的 VHH 溶血素进行化学修饰，发现组氨酸和二硫键修饰试剂抑制了 VHH 的磷脂酶活性，说明其磷脂酶催化中心可能含有组氨酸残基，并且其构象的稳定性依赖于半胱氨酸形成的二硫键。以生物信息学手段查明了 VHH 磷脂酶活性中心的位点，并对其中的关键氨基酸残基-丝
3、氨酸 153 进行了点突变，将其替换成无催化作用的甘氨酸残基，在大肠杆菌表达重组突变蛋白 S153G，并以镍一琼脂糖树脂亲和层析纯化了该蛋白；突变的 VHH 溶血素 S1536 失去了磷脂酶活性、溶血活性和对大菱鲆的致病性，说明 VHH 溶血素的溶血活性和对鱼类的致病性由其磷脂酶活性赋予。对 VHH 溶血素 N 端可能的类 lipocalin 结构域的三个关键氨基酸残基分别进行了突变以瓦解其三级结构，突变的 VHH 溶血素均失去了磷脂酶活性，说明 VHH 溶血素 N 端的可能结构域对于 VHH 溶血素行使其磷脂酶功能是必需的。对 VHH 溶血素的 C 端磷脂酶结构域进行了同源建模，并以所得模型
4、与 VHH 溶血素的底物磷脂酰胆碱进行分子拼接，查明了 VHH 溶血素在催化状态下与底物结合的可能位点，并对这些氨基酸残基分别进行了定点突变。其中，色氨酸 174是 VHH 溶血素与底物的胆碱基团结合的位点，对这一氨基酸残基的突变，导致突变蛋白 W174A 失去了磷脂酶活性，说明色氨酸 174 可能是 VHH 溶血素在催化状态下与底物结合的关键位点。以 Southern 杂交技术检测了 vhh 溶血素基因在VIB645 菌株基因组的分布，结果表明在其染色体和质粒上各有一个 vhh 溶血素基因。本研究促进了对哈维氏弧菌致病机制的深入理解，填补了对弧菌TLH/VHH 类溶血素作用机理认识上的空白，
5、并对促进包括基因工程疫苗在内的环境友好型的哈维氏弧菌病害防治技术有重要的指导意义。正文内容随着水产养殖业近年来的迅速发展，海水养殖动物的细菌性病害造成了巨大的经济损失。由弧菌属细菌(Vibrio spp)引起的弧菌病(Vibriosis)是在世界各地鱼、虾、贝类等海水养殖动物中普遍流行、危害最大的细菌性疾病之一。弧菌是海洋环境中常见细菌类群之一，广泛分布在近岸及河口海水、海洋生物的体表与肠道中，是海水和许多海洋生物的正常菌群。在已知的弧菌中，约 20种是海水养殖动物的病原菌。哈维氏弧菌作为一种重要的海水养殖动物病原弧菌，其危害日益显现。哈维氏弧菌的致病机理还不清楚。 在哈维氏弧菌可能的毒力因子
6、中，VHH 溶血素-一种副溶血弧菌 TLH 类的溶血素，被认为与哈维氏弧菌对鱼的致病性密切相关。本研究以气相色谱技术检测哈维氏弧菌 VHH 溶血素磷脂酶水解磷脂酰胆碱的产物，确定了其磷脂酶活性的类型：VHH 既有磷脂酶 A1 活性，又有磷脂酶 A2 活性，是一种磷脂酶 B。对重组的 VHH 溶血素进行化学修饰，发现组氨酸和二硫键修饰试剂抑制了 VHH 的磷脂酶活性，说明其磷脂酶催化中心可能含有组氨酸残基，并且其构象的稳定性依赖于半胱氨酸形成的二硫键。以生物信息学手段查明了 VHH 磷脂酶活性中心的位点，并对其中的关键氨基酸残基-丝氨酸 153 进行了点突变，将其替换成无催化作用的甘氨酸残基，在
7、大肠杆菌表达重组突变蛋白 S153G，并以镍一琼脂糖树脂亲和层析纯化了该蛋白；突变的 VHH 溶血素 S1536 失去了磷脂酶活性、溶血活性和对大菱鲆的致病性，说明 VHH 溶血素的溶血活性和对鱼类的致病性由其磷脂酶活性赋予。对 VHH 溶血素 N 端可能的类 lipocalin 结构域的三个关键氨基酸残基分别进行了突变以瓦解其三级结构，突变的 VHH 溶血素均失去了磷脂酶活性，说明 VHH 溶血素 N 端的可能结构域对于 VHH 溶血素行使其磷脂酶功能是必需的。对 VHH 溶血素的 C 端磷脂酶结构域进行了同源建模，并以所得模型与 VHH 溶血素的底物磷脂酰胆碱进行分子拼接，查明了 VHH
8、溶血素在催化状态下与底物结合的可能位点，并对这些氨基酸残基分别进行了定点突变。其中，色氨酸 174是 VHH 溶血素与底物的胆碱基团结合的位点，对这一氨基酸残基的突变，导致突变蛋白 W174A 失去了磷脂酶活性，说明色氨酸 174 可能是 VHH 溶血素在催化状态下与底物结合的关键位点。以 Southern 杂交技术检测了 vhh 溶血素基因在VIB645 菌株基因组的分布，结果表明在其染色体和质粒上各有一个 vhh 溶血素基因。本研究促进了对哈维氏弧菌致病机制的深入理解，填补了对弧菌TLH/VHH 类溶血素作用机理认识上的空白，并对促进包括基因工程疫苗在内的环境友好型的哈维氏弧菌病害防治技术
9、有重要的指导意义。随着水产养殖业近年来的迅速发展，海水养殖动物的细菌性病害造成了巨大的经济损失。由弧菌属细菌(Vibrio spp)引起的弧菌病(Vibriosis)是在世界各地鱼、虾、贝类等海水养殖动物中普遍流行、危害最大的细菌性疾病之一。弧菌是海洋环境中常见细菌类群之一，广泛分布在近岸及河口海水、海洋生物的体表与肠道中，是海水和许多海洋生物的正常菌群。在已知的弧菌中，约 20 种是海水养殖动物的病原菌。哈维氏弧菌作为一种重要的海水养殖动物病原弧菌，其危害日益显现。哈维氏弧菌的致病机理还不清楚。 在哈维氏弧菌可能的毒力因子中，VHH 溶血素-一种副溶血弧菌 TLH 类的溶血素，被认为与哈维氏
10、弧菌对鱼的致病性密切相关。本研究以气相色谱技术检测哈维氏弧菌 VHH 溶血素磷脂酶水解磷脂酰胆碱的产物，确定了其磷脂酶活性的类型：VHH 既有磷脂酶A1 活性，又有磷脂酶 A2 活性，是一种磷脂酶 B。对重组的 VHH 溶血素进行化学修饰，发现组氨酸和二硫键修饰试剂抑制了 VHH 的磷脂酶活性，说明其磷脂酶催化中心可能含有组氨酸残基，并且其构象的稳定性依赖于半胱氨酸形成的二硫键。以生物信息学手段查明了 VHH 磷脂酶活性中心的位点，并对其中的关键氨基酸残基-丝氨酸 153 进行了点突变，将其替换成无催化作用的甘氨酸残基，在大肠杆菌表达重组突变蛋白 S153G，并以镍一琼脂糖树脂亲和层析纯化了该
11、蛋白；突变的 VHH 溶血素 S1536 失去了磷脂酶活性、溶血活性和对大菱鲆的致病性，说明 VHH 溶血素的溶血活性和对鱼类的致病性由其磷脂酶活性赋予。对VHH 溶血素 N 端可能的类 lipocalin 结构域的三个关键氨基酸残基分别进行了突变以瓦解其三级结构，突变的 VHH 溶血素均失去了磷脂酶活性，说明 VHH 溶血素 N 端的可能结构域对于 VHH 溶血素行使其磷脂酶功能是必需的。对 VHH 溶血素的 C 端磷脂酶结构域进行了同源建模，并以所得模型与 VHH 溶血素的底物磷脂酰胆碱进行分子拼接，查明了 VHH 溶血素在催化状态下与底物结合的可能位点，并对这些氨基酸残基分别进行了定点突
12、变。其中，色氨酸 174 是 VHH 溶血素与底物的胆碱基团结合的位点，对这一氨基酸残基的突变，导致突变蛋白W174A 失去了磷脂酶活性，说明色氨酸 174 可能是 VHH 溶血素在催化状态下与底物结合的关键位点。以 Southern 杂交技术检测了 vhh 溶血素基因在 VIB645菌株基因组的分布，结果表明在其染色体和质粒上各有一个 vhh 溶血素基因。本研究促进了对哈维氏弧菌致病机制的深入理解，填补了对弧菌 TLH/VHH 类溶血素作用机理认识上的空白，并对促进包括基因工程疫苗在内的环境友好型的哈维氏弧菌病害防治技术有重要的指导意义。随着水产养殖业近年来的迅速发展，海水养殖动物的细菌性病
13、害造成了巨大的经济损失。由弧菌属细菌(Vibrio spp)引起的弧菌病(Vibriosis)是在世界各地鱼、虾、贝类等海水养殖动物中普遍流行、危害最大的细菌性疾病之一。弧菌是海洋环境中常见细菌类群之一，广泛分布在近岸及河口海水、海洋生物的体表与肠道中，是海水和许多海洋生物的正常菌群。在已知的弧菌中，约 20 种是海水养殖动物的病原菌。哈维氏弧菌作为一种重要的海水养殖动物病原弧菌，其危害日益显现。哈维氏弧菌的致病机理还不清楚。 在哈维氏弧菌可能的毒力因子中，VHH 溶血素-一种副溶血弧菌 TLH 类的溶血素，被认为与哈维氏弧菌对鱼的致病性密切相关。本研究以气相色谱技术检测哈维氏弧菌 VHH 溶
14、血素磷脂酶水解磷脂酰胆碱的产物，确定了其磷脂酶活性的类型：VHH 既有磷脂酶A1 活性，又有磷脂酶 A2 活性，是一种磷脂酶 B。对重组的 VHH 溶血素进行化学修饰，发现组氨酸和二硫键修饰试剂抑制了 VHH 的磷脂酶活性，说明其磷脂酶催化中心可能含有组氨酸残基，并且其构象的稳定性依赖于半胱氨酸形成的二硫键。以生物信息学手段查明了 VHH 磷脂酶活性中心的位点，并对其中的关键氨基酸残基-丝氨酸 153 进行了点突变，将其替换成无催化作用的甘氨酸残基，在大肠杆菌表达重组突变蛋白 S153G，并以镍一琼脂糖树脂亲和层析纯化了该蛋白；突变的 VHH 溶血素 S1536 失去了磷脂酶活性、溶血活性和对
15、大菱鲆的致病性，说明 VHH 溶血素的溶血活性和对鱼类的致病性由其磷脂酶活性赋予。对VHH 溶血素 N 端可能的类 lipocalin 结构域的三个关键氨基酸残基分别进行了突变以瓦解其三级结构，突变的 VHH 溶血素均失去了磷脂酶活性，说明 VHH 溶血素 N 端的可能结构域对于 VHH 溶血素行使其磷脂酶功能是必需的。对 VHH 溶血素的 C 端磷脂酶结构域进行了同源建模，并以所得模型与 VHH 溶血素的底物磷脂酰胆碱进行分子拼接，查明了 VHH 溶血素在催化状态下与底物结合的可能位点，并对这些氨基酸残基分别进行了定点突变。其中，色氨酸 174 是 VHH 溶血素与底物的胆碱基团结合的位点，
16、对这一氨基酸残基的突变，导致突变蛋白W174A 失去了磷脂酶活性，说明色氨酸 174 可能是 VHH 溶血素在催化状态下与底物结合的关键位点。以 Southern 杂交技术检测了 vhh 溶血素基因在 VIB645菌株基因组的分布，结果表明在其染色体和质粒上各有一个 vhh 溶血素基因。本研究促进了对哈维氏弧菌致病机制的深入理解，填补了对弧菌 TLH/VHH 类溶血素作用机理认识上的空白，并对促进包括基因工程疫苗在内的环境友好型的哈维氏弧菌病害防治技术有重要的指导意义。随着水产养殖业近年来的迅速发展，海水养殖动物的细菌性病害造成了巨大的经济损失。由弧菌属细菌(Vibrio spp)引起的弧菌病
17、(Vibriosis)是在世界各地鱼、虾、贝类等海水养殖动物中普遍流行、危害最大的细菌性疾病之一。弧菌是海洋环境中常见细菌类群之一，广泛分布在近岸及河口海水、海洋生物的体表与肠道中，是海水和许多海洋生物的正常菌群。在已知的弧菌中，约 20 种是海水养殖动物的病原菌。哈维氏弧菌作为一种重要的海水养殖动物病原弧菌，其危害日益显现。哈维氏弧菌的致病机理还不清楚。 在哈维氏弧菌可能的毒力因子中，VHH 溶血素-一种副溶血弧菌 TLH 类的溶血素，被认为与哈维氏弧菌对鱼的致病性密切相关。本研究以气相色谱技术检测哈维氏弧菌 VHH 溶血素磷脂酶水解磷脂酰胆碱的产物，确定了其磷脂酶活性的类型：VHH 既有磷
18、脂酶A1 活性，又有磷脂酶 A2 活性，是一种磷脂酶 B。对重组的 VHH 溶血素进行化学修饰，发现组氨酸和二硫键修饰试剂抑制了 VHH 的磷脂酶活性，说明其磷脂酶催化中心可能含有组氨酸残基，并且其构象的稳定性依赖于半胱氨酸形成的二硫键。以生物信息学手段查明了 VHH 磷脂酶活性中心的位点，并对其中的关键氨基酸残基-丝氨酸 153 进行了点突变，将其替换成无催化作用的甘氨酸残基，在大肠杆菌表达重组突变蛋白 S153G，并以镍一琼脂糖树脂亲和层析纯化了该蛋白；突变的 VHH 溶血素 S1536 失去了磷脂酶活性、溶血活性和对大菱鲆的致病性，说明 VHH 溶血素的溶血活性和对鱼类的致病性由其磷脂酶
19、活性赋予。对VHH 溶血素 N 端可能的类 lipocalin 结构域的三个关键氨基酸残基分别进行了突变以瓦解其三级结构，突变的 VHH 溶血素均失去了磷脂酶活性，说明 VHH 溶血素 N 端的可能结构域对于 VHH 溶血素行使其磷脂酶功能是必需的。对 VHH 溶血素的 C 端磷脂酶结构域进行了同源建模，并以所得模型与 VHH 溶血素的底物磷脂酰胆碱进行分子拼接，查明了 VHH 溶血素在催化状态下与底物结合的可能位点，并对这些氨基酸残基分别进行了定点突变。其中，色氨酸 174 是 VHH 溶血素与底物的胆碱基团结合的位点，对这一氨基酸残基的突变，导致突变蛋白W174A 失去了磷脂酶活性，说明色
20、氨酸 174 可能是 VHH 溶血素在催化状态下与底物结合的关键位点。以 Southern 杂交技术检测了 vhh 溶血素基因在 VIB645菌株基因组的分布，结果表明在其染色体和质粒上各有一个 vhh 溶血素基因。本研究促进了对哈维氏弧菌致病机制的深入理解，填补了对弧菌 TLH/VHH 类溶血素作用机理认识上的空白，并对促进包括基因工程疫苗在内的环境友好型的哈维氏弧菌病害防治技术有重要的指导意义。随着水产养殖业近年来的迅速发展，海水养殖动物的细菌性病害造成了巨大的经济损失。由弧菌属细菌(Vibrio spp)引起的弧菌病(Vibriosis)是在世界各地鱼、虾、贝类等海水养殖动物中普遍流行、
21、危害最大的细菌性疾病之一。弧菌是海洋环境中常见细菌类群之一，广泛分布在近岸及河口海水、海洋生物的体表与肠道中，是海水和许多海洋生物的正常菌群。在已知的弧菌中，约 20 种是海水养殖动物的病原菌。哈维氏弧菌作为一种重要的海水养殖动物病原弧菌，其危害日益显现。哈维氏弧菌的致病机理还不清楚。 在哈维氏弧菌可能的毒力因子中，VHH 溶血素-一种副溶血弧菌 TLH 类的溶血素，被认为与哈维氏弧菌对鱼的致病性密切相关。本研究以气相色谱技术检测哈维氏弧菌 VHH 溶血素磷脂酶水解磷脂酰胆碱的产物，确定了其磷脂酶活性的类型：VHH 既有磷脂酶A1 活性，又有磷脂酶 A2 活性，是一种磷脂酶 B。对重组的 VH
22、H 溶血素进行化学修饰，发现组氨酸和二硫键修饰试剂抑制了 VHH 的磷脂酶活性，说明其磷脂酶催化中心可能含有组氨酸残基，并且其构象的稳定性依赖于半胱氨酸形成的二硫键。以生物信息学手段查明了 VHH 磷脂酶活性中心的位点，并对其中的关键氨基酸残基-丝氨酸 153 进行了点突变，将其替换成无催化作用的甘氨酸残基，在大肠杆菌表达重组突变蛋白 S153G，并以镍一琼脂糖树脂亲和层析纯化了该蛋白；突变的 VHH 溶血素 S1536 失去了磷脂酶活性、溶血活性和对大菱鲆的致病性，说明 VHH 溶血素的溶血活性和对鱼类的致病性由其磷脂酶活性赋予。对VHH 溶血素 N 端可能的类 lipocalin 结构域的
23、三个关键氨基酸残基分别进行了突变以瓦解其三级结构，突变的 VHH 溶血素均失去了磷脂酶活性，说明 VHH 溶血素 N 端的可能结构域对于 VHH 溶血素行使其磷脂酶功能是必需的。对 VHH 溶血素的 C 端磷脂酶结构域进行了同源建模，并以所得模型与 VHH 溶血素的底物磷脂酰胆碱进行分子拼接，查明了 VHH 溶血素在催化状态下与底物结合的可能位点，并对这些氨基酸残基分别进行了定点突变。其中，色氨酸 174 是 VHH 溶血素与底物的胆碱基团结合的位点，对这一氨基酸残基的突变，导致突变蛋白W174A 失去了磷脂酶活性，说明色氨酸 174 可能是 VHH 溶血素在催化状态下与底物结合的关键位点。以
24、 Southern 杂交技术检测了 vhh 溶血素基因在 VIB645菌株基因组的分布，结果表明在其染色体和质粒上各有一个 vhh 溶血素基因。本研究促进了对哈维氏弧菌致病机制的深入理解，填补了对弧菌 TLH/VHH 类溶血素作用机理认识上的空白，并对促进包括基因工程疫苗在内的环境友好型的哈维氏弧菌病害防治技术有重要的指导意义。随着水产养殖业近年来的迅速发展，海水养殖动物的细菌性病害造成了巨大的经济损失。由弧菌属细菌(Vibrio spp)引起的弧菌病(Vibriosis)是在世界各地鱼、虾、贝类等海水养殖动物中普遍流行、危害最大的细菌性疾病之一。弧菌是海洋环境中常见细菌类群之一，广泛分布在近
25、岸及河口海水、海洋生物的体表与肠道中，是海水和许多海洋生物的正常菌群。在已知的弧菌中，约 20 种是海水养殖动物的病原菌。哈维氏弧菌作为一种重要的海水养殖动物病原弧菌，其危害日益显现。哈维氏弧菌的致病机理还不清楚。 在哈维氏弧菌可能的毒力因子中，VHH 溶血素-一种副溶血弧菌 TLH 类的溶血素，被认为与哈维氏弧菌对鱼的致病性密切相关。本研究以气相色谱技术检测哈维氏弧菌 VHH 溶血素磷脂酶水解磷脂酰胆碱的产物，确定了其磷脂酶活性的类型：VHH 既有磷脂酶A1 活性，又有磷脂酶 A2 活性，是一种磷脂酶 B。对重组的 VHH 溶血素进行化学修饰，发现组氨酸和二硫键修饰试剂抑制了 VHH 的磷脂
26、酶活性，说明其磷脂酶催化中心可能含有组氨酸残基，并且其构象的稳定性依赖于半胱氨酸形成的二硫键。以生物信息学手段查明了 VHH 磷脂酶活性中心的位点，并对其中的关键氨基酸残基-丝氨酸 153 进行了点突变，将其替换成无催化作用的甘氨酸残基，在大肠杆菌表达重组突变蛋白 S153G，并以镍一琼脂糖树脂亲和层析纯化了该蛋白；突变的 VHH 溶血素 S1536 失去了磷脂酶活性、溶血活性和对大菱鲆的致病性，说明 VHH 溶血素的溶血活性和对鱼类的致病性由其磷脂酶活性赋予。对VHH 溶血素 N 端可能的类 lipocalin 结构域的三个关键氨基酸残基分别进行了突变以瓦解其三级结构，突变的 VHH 溶血素
27、均失去了磷脂酶活性，说明 VHH 溶血素 N 端的可能结构域对于 VHH 溶血素行使其磷脂酶功能是必需的。对 VHH 溶血素的 C 端磷脂酶结构域进行了同源建模，并以所得模型与 VHH 溶血素的底物磷脂酰胆碱进行分子拼接，查明了 VHH 溶血素在催化状态下与底物结合的可能位点，并对这些氨基酸残基分别进行了定点突变。其中，色氨酸 174 是 VHH 溶血素与底物的胆碱基团结合的位点，对这一氨基酸残基的突变，导致突变蛋白W174A 失去了磷脂酶活性，说明色氨酸 174 可能是 VHH 溶血素在催化状态下与底物结合的关键位点。以 Southern 杂交技术检测了 vhh 溶血素基因在 VIB645菌
28、株基因组的分布，结果表明在其染色体和质粒上各有一个 vhh 溶血素基因。本研究促进了对哈维氏弧菌致病机制的深入理解，填补了对弧菌 TLH/VHH 类溶血素作用机理认识上的空白，并对促进包括基因工程疫苗在内的环境友好型的哈维氏弧菌病害防治技术有重要的指导意义。随着水产养殖业近年来的迅速发展，海水养殖动物的细菌性病害造成了巨大的经济损失。由弧菌属细菌(Vibrio spp)引起的弧菌病(Vibriosis)是在世界各地鱼、虾、贝类等海水养殖动物中普遍流行、危害最大的细菌性疾病之一。弧菌是海洋环境中常见细菌类群之一，广泛分布在近岸及河口海水、海洋生物的体表与肠道中，是海水和许多海洋生物的正常菌群。在
29、已知的弧菌中，约 20 种是海水养殖动物的病原菌。哈维氏弧菌作为一种重要的海水养殖动物病原弧菌，其危害日益显现。哈维氏弧菌的致病机理还不清楚。 在哈维氏弧菌可能的毒力因子中，VHH 溶血素-一种副溶血弧菌 TLH 类的溶血素，被认为与哈维氏弧菌对鱼的致病性密切相关。本研究以气相色谱技术检测哈维氏弧菌 VHH 溶血素磷脂酶水解磷脂酰胆碱的产物，确定了其磷脂酶活性的类型：VHH 既有磷脂酶A1 活性，又有磷脂酶 A2 活性，是一种磷脂酶 B。对重组的 VHH 溶血素进行化学修饰，发现组氨酸和二硫键修饰试剂抑制了 VHH 的磷脂酶活性，说明其磷脂酶催化中心可能含有组氨酸残基，并且其构象的稳定性依赖于
30、半胱氨酸形成的二硫键。以生物信息学手段查明了 VHH 磷脂酶活性中心的位点，并对其中的关键氨基酸残基-丝氨酸 153 进行了点突变，将其替换成无催化作用的甘氨酸残基，在大肠杆菌表达重组突变蛋白 S153G，并以镍一琼脂糖树脂亲和层析纯化了该蛋白；突变的 VHH 溶血素 S1536 失去了磷脂酶活性、溶血活性和对大菱鲆的致病性，说明 VHH 溶血素的溶血活性和对鱼类的致病性由其磷脂酶活性赋予。对VHH 溶血素 N 端可能的类 lipocalin 结构域的三个关键氨基酸残基分别进行了突变以瓦解其三级结构，突变的 VHH 溶血素均失去了磷脂酶活性，说明 VHH 溶血素 N 端的可能结构域对于 VHH
31、 溶血素行使其磷脂酶功能是必需的。对 VHH 溶血素的 C 端磷脂酶结构域进行了同源建模，并以所得模型与 VHH 溶血素的底物磷脂酰胆碱进行分子拼接，查明了 VHH 溶血素在催化状态下与底物结合的可能位点，并对这些氨基酸残基分别进行了定点突变。其中，色氨酸 174 是 VHH 溶血素与底物的胆碱基团结合的位点，对这一氨基酸残基的突变，导致突变蛋白W174A 失去了磷脂酶活性，说明色氨酸 174 可能是 VHH 溶血素在催化状态下与底物结合的关键位点。以 Southern 杂交技术检测了 vhh 溶血素基因在 VIB645菌株基因组的分布，结果表明在其染色体和质粒上各有一个 vhh 溶血素基因。
32、本研究促进了对哈维氏弧菌致病机制的深入理解，填补了对弧菌 TLH/VHH 类溶血素作用机理认识上的空白，并对促进包括基因工程疫苗在内的环境友好型的哈维氏弧菌病害防治技术有重要的指导意义。随着水产养殖业近年来的迅速发展，海水养殖动物的细菌性病害造成了巨大的经济损失。由弧菌属细菌(Vibrio spp)引起的弧菌病(Vibriosis)是在世界各地鱼、虾、贝类等海水养殖动物中普遍流行、危害最大的细菌性疾病之一。弧菌是海洋环境中常见细菌类群之一，广泛分布在近岸及河口海水、海洋生物的体表与肠道中，是海水和许多海洋生物的正常菌群。在已知的弧菌中，约 20 种是海水养殖动物的病原菌。哈维氏弧菌作为一种重要
33、的海水养殖动物病原弧菌，其危害日益显现。哈维氏弧菌的致病机理还不清楚。 在哈维氏弧菌可能的毒力因子中，VHH 溶血素-一种副溶血弧菌 TLH 类的溶血素，被认为与哈维氏弧菌对鱼的致病性密切相关。本研究以气相色谱技术检测哈维氏弧菌 VHH 溶血素磷脂酶水解磷脂酰胆碱的产物，确定了其磷脂酶活性的类型：VHH 既有磷脂酶A1 活性，又有磷脂酶 A2 活性，是一种磷脂酶 B。对重组的 VHH 溶血素进行化学修饰，发现组氨酸和二硫键修饰试剂抑制了 VHH 的磷脂酶活性，说明其磷脂酶催化中心可能含有组氨酸残基，并且其构象的稳定性依赖于半胱氨酸形成的二硫键。以生物信息学手段查明了 VHH 磷脂酶活性中心的位
34、点，并对其中的关键氨基酸残基-丝氨酸 153 进行了点突变，将其替换成无催化作用的甘氨酸残基，在大肠杆菌表达重组突变蛋白 S153G，并以镍一琼脂糖树脂亲和层析纯化了该蛋白；突变的 VHH 溶血素 S1536 失去了磷脂酶活性、溶血活性和对大菱鲆的致病性，说明 VHH 溶血素的溶血活性和对鱼类的致病性由其磷脂酶活性赋予。对VHH 溶血素 N 端可能的类 lipocalin 结构域的三个关键氨基酸残基分别进行了突变以瓦解其三级结构，突变的 VHH 溶血素均失去了磷脂酶活性，说明 VHH 溶血素 N 端的可能结构域对于 VHH 溶血素行使其磷脂酶功能是必需的。对 VHH 溶血素的 C 端磷脂酶结构
35、域进行了同源建模，并以所得模型与 VHH 溶血素的底物磷脂酰胆碱进行分子拼接，查明了 VHH 溶血素在催化状态下与底物结合的可能位点，并对这些氨基酸残基分别进行了定点突变。其中，色氨酸 174 是 VHH 溶血素与底物的胆碱基团结合的位点，对这一氨基酸残基的突变，导致突变蛋白W174A 失去了磷脂酶活性，说明色氨酸 174 可能是 VHH 溶血素在催化状态下与底物结合的关键位点。以 Southern 杂交技术检测了 vhh 溶血素基因在 VIB645菌株基因组的分布，结果表明在其染色体和质粒上各有一个 vhh 溶血素基因。本研究促进了对哈维氏弧菌致病机制的深入理解，填补了对弧菌 TLH/VHH
36、 类溶血素作用机理认识上的空白，并对促进包括基因工程疫苗在内的环境友好型的哈维氏弧菌病害防治技术有重要的指导意义。随着水产养殖业近年来的迅速发展，海水养殖动物的细菌性病害造成了巨大的经济损失。由弧菌属细菌(Vibrio spp)引起的弧菌病(Vibriosis)是在世界各地鱼、虾、贝类等海水养殖动物中普遍流行、危害最大的细菌性疾病之一。弧菌是海洋环境中常见细菌类群之一，广泛分布在近岸及河口海水、海洋生物的体表与肠道中，是海水和许多海洋生物的正常菌群。在已知的弧菌中，约 20 种是海水养殖动物的病原菌。哈维氏弧菌作为一种重要的海水养殖动物病原弧菌，其危害日益显现。哈维氏弧菌的致病机理还不清楚。
37、在哈维氏弧菌可能的毒力因子中，VHH 溶血素-一种副溶血弧菌 TLH 类的溶血素，被认为与哈维氏弧菌对鱼的致病性密切相关。本研究以气相色谱技术检测哈维氏弧菌 VHH 溶血素磷脂酶水解磷脂酰胆碱的产物，确定了其磷脂酶活性的类型：VHH 既有磷脂酶A1 活性，又有磷脂酶 A2 活性，是一种磷脂酶 B。对重组的 VHH 溶血素进行化学修饰，发现组氨酸和二硫键修饰试剂抑制了 VHH 的磷脂酶活性，说明其磷脂酶催化中心可能含有组氨酸残基，并且其构象的稳定性依赖于半胱氨酸形成的二硫键。以生物信息学手段查明了 VHH 磷脂酶活性中心的位点，并对其中的关键氨基酸残基-丝氨酸 153 进行了点突变，将其替换成无
38、催化作用的甘氨酸残基，在大肠杆菌表达重组突变蛋白 S153G，并以镍一琼脂糖树脂亲和层析纯化了该蛋白；突变的 VHH 溶血素 S1536 失去了磷脂酶活性、溶血活性和对大菱鲆的致病性，说明 VHH 溶血素的溶血活性和对鱼类的致病性由其磷脂酶活性赋予。对VHH 溶血素 N 端可能的类 lipocalin 结构域的三个关键氨基酸残基分别进行了突变以瓦解其三级结构，突变的 VHH 溶血素均失去了磷脂酶活性，说明 VHH 溶血素 N 端的可能结构域对于 VHH 溶血素行使其磷脂酶功能是必需的。对 VHH 溶血素的 C 端磷脂酶结构域进行了同源建模，并以所得模型与 VHH 溶血素的底物磷脂酰胆碱进行分子
39、拼接，查明了 VHH 溶血素在催化状态下与底物结合的可能位点，并对这些氨基酸残基分别进行了定点突变。其中，色氨酸 174 是 VHH 溶血素与底物的胆碱基团结合的位点，对这一氨基酸残基的突变，导致突变蛋白W174A 失去了磷脂酶活性，说明色氨酸 174 可能是 VHH 溶血素在催化状态下与底物结合的关键位点。以 Southern 杂交技术检测了 vhh 溶血素基因在 VIB645菌株基因组的分布，结果表明在其染色体和质粒上各有一个 vhh 溶血素基因。本研究促进了对哈维氏弧菌致病机制的深入理解，填补了对弧菌 TLH/VHH 类溶血素作用机理认识上的空白，并对促进包括基因工程疫苗在内的环境友好型
40、的哈维氏弧菌病害防治技术有重要的指导意义。随着水产养殖业近年来的迅速发展，海水养殖动物的细菌性病害造成了巨大的经济损失。由弧菌属细菌(Vibrio spp)引起的弧菌病(Vibriosis)是在世界各地鱼、虾、贝类等海水养殖动物中普遍流行、危害最大的细菌性疾病之一。弧菌是海洋环境中常见细菌类群之一，广泛分布在近岸及河口海水、海洋生物的体表与肠道中，是海水和许多海洋生物的正常菌群。在已知的弧菌中，约 20 种是海水养殖动物的病原菌。哈维氏弧菌作为一种重要的海水养殖动物病原弧菌，其危害日益显现。哈维氏弧菌的致病机理还不清楚。 在哈维氏弧菌可能的毒力因子中，VHH 溶血素-一种副溶血弧菌 TLH 类
41、的溶血素，被认为与哈维氏弧菌对鱼的致病性密切相关。本研究以气相色谱技术检测哈维氏弧菌 VHH 溶血素磷脂酶水解磷脂酰胆碱的产物，确定了其磷脂酶活性的类型：VHH 既有磷脂酶A1 活性，又有磷脂酶 A2 活性，是一种磷脂酶 B。对重组的 VHH 溶血素进行化学修饰，发现组氨酸和二硫键修饰试剂抑制了 VHH 的磷脂酶活性，说明其磷脂酶催化中心可能含有组氨酸残基，并且其构象的稳定性依赖于半胱氨酸形成的二硫键。以生物信息学手段查明了 VHH 磷脂酶活性中心的位点，并对其中的关键氨基酸残基-丝氨酸 153 进行了点突变，将其替换成无催化作用的甘氨酸残基，在大肠杆菌表达重组突变蛋白 S153G，并以镍一琼
42、脂糖树脂亲和层析纯化了该蛋白；突变的 VHH 溶血素 S1536 失去了磷脂酶活性、溶血活性和对大菱鲆的致病性，说明 VHH 溶血素的溶血活性和对鱼类的致病性由其磷脂酶活性赋予。对VHH 溶血素 N 端可能的类 lipocalin 结构域的三个关键氨基酸残基分别进行了突变以瓦解其三级结构，突变的 VHH 溶血素均失去了磷脂酶活性，说明 VHH 溶血素 N 端的可能结构域对于 VHH 溶血素行使其磷脂酶功能是必需的。对 VHH 溶血素的 C 端磷脂酶结构域进行了同源建模，并以所得模型与 VHH 溶血素的底物磷脂酰胆碱进行分子拼接，查明了 VHH 溶血素在催化状态下与底物结合的可能位点，并对这些氨
43、基酸残基分别进行了定点突变。其中，色氨酸 174 是 VHH 溶血素与底物的胆碱基团结合的位点，对这一氨基酸残基的突变，导致突变蛋白W174A 失去了磷脂酶活性，说明色氨酸 174 可能是 VHH 溶血素在催化状态下与底物结合的关键位点。以 Southern 杂交技术检测了 vhh 溶血素基因在 VIB645菌株基因组的分布，结果表明在其染色体和质粒上各有一个 vhh 溶血素基因。本研究促进了对哈维氏弧菌致病机制的深入理解，填补了对弧菌 TLH/VHH 类溶血素作用机理认识上的空白，并对促进包括基因工程疫苗在内的环境友好型的哈维氏弧菌病害防治技术有重要的指导意义。特别提醒 ：正文内容由 PDF
44、 文件转码生成，如您电脑未有相应转换码，则无法显示正文内容，请您下载相应软件，下载地址为 http:/ 。如还不能显示，可以联系我 q q 1627550258 ，提供原格式文档。“垐垯櫃 换烫梯葺铑?endstreamendobj2x 滌?U 閩 AZ箾 FTP 鈦X 飼?狛P? 燚?琯嫼 b?袍*甒?颙嫯?4)=r 宵?i?j 彺帖 B3 锝檡骹笪 yLrQ#?0 鯖 l 壛枒l 壛枒 l 壛枒 l 壛枒 l 壛枒 l 壛枒 l 壛枒 l 壛枒 l 壛枒 l 壛枒 l 壛枒 l 壛渓?擗#?“?# 綫 G 刿#K 芿$?7. 耟?Wa 癳$Fb 癳$Fb 癳$Fb 癳$Fb 癳$Fb 癳$Fb 癳$Fb 癳$Fb癳$Fb 癳$Fb 癳$Fb 癳$Fb 癳$Fb 癳$Fb 癳$Fb 皗 E|?pDb 癳$Fb 癳$Fb癳$Fb 癳$Fb 癳$Fb 癳$Fb 癳$Fb 癳$Fb 癳$Fb 癳$Fb 癳$Fb 癳$Fb 癳$Fb 癳$Fb 癳$F?責鯻 0 橔 C,f 薍秾腵薍秾腵薍秾腵薍秾腵薍秾腵薍秾腵薍秾腵薍秾腵薍秾腵薍秾腵薍秾腵薍秾腵薍秾腵薍秾腵薍秾腵秾腵薍秾腵%?秾腵薍秾腵薍
