1、预防兽医学专业毕业论文 精品论文 反向遗传技术研究新城疫病毒 P 基因功能及其对病毒毒力的影响关键词：禽类 新城疫病毒 反向遗传 P 基因 V 蛋白 C 端结构域 顺序编码摘要：新城疫(Newcastledisease，ND)是一种严重的传染性疾病，能够感染多种禽类，给世界养禽业造成了巨大的损失。测定了鹅源 NDV 强毒株 ZJ1 的全基因组序列，并在此基础上构建了该基因组 cDNA 的全长克隆以及分别表达该毒株NP、P 以及 L 蛋白的 3 个真核表达质粒，通过病毒的体外包装技术，拯救出了具有感染性的病毒粒子，成功建立了鹅源 NDV 的反向遗传操作技术平台，这也为从病毒生物学特性的角度研究
2、P 基因提供了技术支持。 1.基因 III 型和IX 型新城疫病毒全基因组测序及其在新城疫进化史中的重要地位分析 根据EMBL/GenBank 中已发表的基因 III 型 NDV 全基因和基因 IX 型 NDV 基因片段设计一套全基因引物，将 NDV 全基因分为 10 个相互重叠的片段进行 RT-PCR 扩增。PCR 产物连入 pGEM-Teasy 载体测序后应用 DNAStar 软件进行遗传进化分析。我们测定了 5 株基因 IX 型 NDV 和 2 株基因 III 型全基因组序列并进行遗传进化分析。实验数据显示，虽然两种基因型毒株同源性较高，但是基因 IX 型 NDVNP 基因内确实存在 6
3、nt 插入片段，基因全长为 15，192nt，是与基因 III 型 NDV 不同的毒株。鉴于基因 IX 型代表株 F48E8 的分离时间，可以确定早在上世纪三、四十年代就已经存在全长 15，192nt 的毒株。值得注意的是，常用的遗传进化分析以及限制性内切酶位点(RE)分析并不能有效的区分这两种基因型以及 IV 型，NP 基因 5端非编码区核苷酸长度才是最可靠的遗传标志。最后，根据两个基因型毒株相近的分离时间和高度的同源性，我们推测最早有一群 NDV 毒株在遗传进化过程中分化为两支，保持 15，186nt 基因组长度的一支演变为基因 III型、IV 型及相关毒株；而另外一支，在 NP 基因 5
4、-NCR 插入 6 个核苷酸，产生了 15，192nt 基因组长度的毒株，可能即为最早的基因 IX 型毒株，再逐步进化演变为后来的基因 VVIII 型。 2.新城疫病毒 P/V/W 基因编码产物的结构域分析及针对 V 蛋白 C 端结构域的抗体制备 根据 EMBL/GenBank 上发布的NDV 基因序列，分别设计针对基因 II、III、VI 和 VII 型以及 classINDV 毒株P 基因的引物。RT-PCR 扩增后测序，从而获得 5 种基因型 NDVP 基因的正确序列。通过核苷酸序列预测 P 基因表达产物的氨基酸序列，并进行二级结构预测和三级结构模拟。实验结果发现，腮腺炎病毒属的猴副流感
5、病毒 V 型(Simianvirus5，SV5)的 V 蛋白与 NDVV 蛋白的氨基酸序列同源性以及二级结构的相似性均较高，可以将其空间结构作为模板模拟 NDVV 蛋白以及 P 蛋白 N 端的空间结构。综合各种分析数据，可以确定 P 蛋白辅助 N 蛋白折叠的结构域位于N 端前 50aa 内，其中 20aa-29aa 预测为一个潜在的疏水性 -螺旋；50aa-131aa 结构紊乱；预测 P 蛋白螺旋卷曲结构位于 221aa-290aa 范围内，可能介导了 P 蛋白四聚体的形成以及与 L 蛋白的相互作用：预测 NDV 的 X 结构域位于291aa-392aa 范围内，其中 350aa-392aa
6、区域内存在 3 个相连的 -螺旋，其二级结构与副粘病毒 X 结构域的 C 端亚单位结构相似，可能介导了 P 蛋白与衣壳化基因组的相互作用。V 蛋白的 C 端结构域(C-terminaldomain，CTD)的编码区域位于 P 蛋白 132aa-239aa 区域内，与螺旋卷曲结构部分重叠。最后，根据分析结果将基因 VII 型 NDV 毒株 ZJ1V 蛋白 CTD 的序列插入 pGEX-6p-1 表达载体中诱导表达。表达产物通过切胶免疫的方法多次免疫小鼠，结果获得抗 V 蛋白CTD 的多抗血清。利用间接免疫荧光鉴定多抗血清与病毒蛋白的反应情况，证明制备的抗 CTD 血清能够与 NDV 感染 ver
7、o 细胞作用，与正常 Vero 细胞不反应，为后续的研究工作奠定了基础。 3.不同基因型新城疫病毒 P 基因对病毒毒力的影响 利用 BglII 酶切全长质粒 pNDV/ZJ1，成功构建含有 TVT 载体、NP 基因、P 基因以及很少部分 M 基因和 L 基因片段的中间质粒 pTX37。PCR 分别分别扩增 NDV 基因 II 型疫苗株 LaSota、基因 III 型中等毒力株 JS/05/9/Go 和基因VII 型强毒株 JS/05/5/Go 的 P 基因，上游引物突变引入 SmaI 的酶切位点，下游引物突变出 ApaI 酶切位点。通过 SmaI 和 ApaI 将 3 株病毒的 P 基因替换进
8、入中间载体 pTX37，再利用 Bst217I 和 XbaI 将重组质粒连入 NDV 基因组全长转录载体质粒。重组的 3 种 NDV 基因组全长转录载体质粒与 3 个辅助表达质粒 pCI-L、pCI-NP 和 pCI-P 共转染 BSR-T7/5 细胞，成功拯救出了 P 基因替换株 RZJ-LP，RZJ-4P，RZJ-IP。通过 MDT、ICPI、IVPI、细胞致病力以及生长曲线的检测，发现 3 株 P 基因替换株的毒力变现明显的差异：RZJ-LP 和 RZJ-4P 在细胞上的生长滞后于亲本病毒 ZJ1，细胞上清中的病毒含量比 ZJ1 低 10 倍左右；RZJ-4P 和 RZJ-LP 的 IC
9、PI 从 ZJ1 的 2.54 下降至 2.33 和 1.51；RZJ-IP 表现出了比 ZJ1 更强的感染力，感染细胞后最早出现病变的时间和完全破坏单层细胞的时间比 ZJ1 还要早 12h-24h。3 株 P 基因替换株的毒力强弱排序与其 P 基因来源毒株的毒力强弱排序相同，表明 P 基因是影响 NDV 毒力的因素之一。 4.新城疫病毒 P 基因编码产物的结构域对病毒生物学活性的影响 通过 SmaI 和ApaI 的酶切位点，将基因 II 型疫苗株 LaSotaP 基因 RNA 编辑位点上游部分和下游部分分别替换进入基因 VII 型 NDVZJ1，成功拯救了具有嵌合 P 基因的两株重组病毒 R
10、ZJ-LaN 和 RZJ-LaC。通过 PCR 在中间质粒 pTX37 的 P 基因 RNA 编辑位点后进行点突变引入终止密码子 TAG，拯救 V 蛋白 C 端结构域缺失株 RZJ-VS和荧光标记的 RZJ-VS/GFP，重组病毒 P 蛋白的正常表达不受影响，而由+1GmRNA 编码的 V 蛋白翻译到 RNA 编辑位点后即终止。通过 MDT、ICPI、IVPI、细胞致病力以及生长曲线的检测，发现 RZJ-LaN 和 RZJ-LaC 的毒力比亲本病毒稍弱，但明显强于 P 基因替换株 RZJ-LP，表明上一章中发现的 RZJ-LP 毒力大幅度下降是由 P 蛋白和 V 蛋白的多个结构域协同作用的结果
11、，并非是单个结构域导致。在没有干扰素系统的 Vero 细胞上 RZJ-LP、RZJ-LaN 和 RZJ-LaC 生长曲线基本重合，而在原代细胞 CEF、GEF 上 RZJ-LaN 的增殖能力最强，RZJ-LaC 最弱，RZJ-LaN 感染细胞中病毒的最高含量比 RZJ-LP 高 510 倍，RZJ-LP 比RZJ-LaC 高 510 倍，表明 ZJ1V 蛋白 CTD 的干扰素拮抗能力强于 LaSota。V 蛋白缺失株的生物学活性与相关报道完全相反，在细胞和鸡胚中的生长不受影响，接种 Vero、CEF 和 GEF 细胞以后，细胞病变以圆缩脱落为主，单层细胞完全破环的时间超过 72h。这种细胞病变
12、过程与亲本病毒完全不同，暗示 V 蛋白的 CTD结构域应该具有未知的功能。检测荧光发现，RZJ-VS/GFP 和 RZJ/GFP 在以0.01MOI 接种细胞后 12h 都出现了很强的荧光，24h 后绝大多数单层细胞出现荧光，这表明 ZJ1 株的复制和传播能力非常的强，感染速度超过了细胞抗病毒免疫启动的速度，推测基因 VII 型 NDV 高效的增殖和传播能力也是其免疫逃避的机制之一 全文小结： (1)测定了 2 株基因 III 型和 5 株基因 IX 型 NDV 的全基因组序列，证实两种基因型毒株虽然同源性较高，但是基因 IX 型 NDV 确实有 6nt 插入片段，基因全长为 15，192nt
13、，是最早出现的 15，192nt 基因组长度毒株。分析后推测，NDV 毒株在遗传进化过程中分化为两支，保持 15，186nt基因组长度的一支演变为基因 III 型、IV 型及相关毒株；而另外一支，在 NP基因中插入 6 个核苷酸，产生了 15，192nt 基因组长度的毒株，可能即为最早的基因 IX 型毒株，再逐步进化演变为后来的基因 VVIII 型。 (2)通过对 P基因表达产物的生物信息学分析，确定 P 蛋白和 V 蛋白结构域的大致位置。 (3)通过反向遗传平台，替换基因 VII 型强毒 ZJ1 的 P 基因全基因或部分结构域，成功拯救 5 株重组病毒。3 株 P 基因替换株的毒力强弱排序与
14、其 P 基因来源毒株的毒力强弱排序相同，证实 P 基因是影响毒力的因素之一，同时发现 P 基因对毒力的影响是由多个结构域共同参与，而非单一结构域决定。 (4)利用反向遗传平台，成功拯救 2 株 V 蛋白 C 端结构域缺失病毒，证实在相同病毒骨架下，ZJIV 蛋白的干扰素拮抗能力强于 LaSota。V 蛋白 C 端结构域缺失株的生物学特性与亲本病毒差异不大，明显与 NDV 同类研究结果相反，推测基因 VII 型NDV 高效的增殖和感染能力也是其免疫逃避机制之一。 (5)细胞感染 RZJ-VS以后，CPE 明显改变，细胞以圆缩脱落为主，单层细胞完全破环的时间大幅度延长，暗示 V 蛋白的 C 端结构
15、域应该具有未知的功能。正文内容新城疫(Newcastledisease，ND)是一种严重的传染性疾病，能够感染多种禽类，给世界养禽业造成了巨大的损失。测定了鹅源 NDV 强毒株 ZJ1 的全基因组序列，并在此基础上构建了该基因组 cDNA 的全长克隆以及分别表达该毒株NP、P 以及 L 蛋白的 3 个真核表达质粒，通过病毒的体外包装技术，拯救出了具有感染性的病毒粒子，成功建立了鹅源 NDV 的反向遗传操作技术平台，这也为从病毒生物学特性的角度研究 P 基因提供了技术支持。 1.基因 III 型和IX 型新城疫病毒全基因组测序及其在新城疫进化史中的重要地位分析 根据EMBL/GenBank 中已
16、发表的基因 III 型 NDV 全基因和基因 IX 型 NDV 基因片段设计一套全基因引物，将 NDV 全基因分为 10 个相互重叠的片段进行 RT-PCR 扩增。PCR 产物连入 pGEM-Teasy 载体测序后应用 DNAStar 软件进行遗传进化分析。我们测定了 5 株基因 IX 型 NDV 和 2 株基因 III 型全基因组序列并进行遗传进化分析。实验数据显示，虽然两种基因型毒株同源性较高，但是基因 IX 型 NDVNP 基因内确实存在 6nt 插入片段，基因全长为 15，192nt，是与基因 III 型 NDV 不同的毒株。鉴于基因 IX 型代表株 F48E8 的分离时间，可以确定早
17、在上世纪三、四十年代就已经存在全长 15，192nt 的毒株。值得注意的是，常用的遗传进化分析以及限制性内切酶位点(RE)分析并不能有效的区分这两种基因型以及 IV 型，NP 基因 5端非编码区核苷酸长度才是最可靠的遗传标志。最后，根据两个基因型毒株相近的分离时间和高度的同源性，我们推测最早有一群 NDV 毒株在遗传进化过程中分化为两支，保持 15，186nt 基因组长度的一支演变为基因 III型、IV 型及相关毒株；而另外一支，在 NP 基因 5-NCR 插入 6 个核苷酸，产生了 15，192nt 基因组长度的毒株，可能即为最早的基因 IX 型毒株，再逐步进化演变为后来的基因 VVIII
18、型。 2.新城疫病毒 P/V/W 基因编码产物的结构域分析及针对 V 蛋白 C 端结构域的抗体制备 根据 EMBL/GenBank 上发布的NDV 基因序列，分别设计针对基因 II、III、VI 和 VII 型以及 classINDV 毒株P 基因的引物。RT-PCR 扩增后测序，从而获得 5 种基因型 NDVP 基因的正确序列。通过核苷酸序列预测 P 基因表达产物的氨基酸序列，并进行二级结构预测和三级结构模拟。实验结果发现，腮腺炎病毒属的猴副流感病毒 V 型(Simianvirus5，SV5)的 V 蛋白与 NDVV 蛋白的氨基酸序列同源性以及二级结构的相似性均较高，可以将其空间结构作为模板
19、模拟 NDVV 蛋白以及 P 蛋白 N 端的空间结构。综合各种分析数据，可以确定 P 蛋白辅助 N 蛋白折叠的结构域位于N 端前 50aa 内，其中 20aa-29aa 预测为一个潜在的疏水性 -螺旋；50aa-131aa 结构紊乱；预测 P 蛋白螺旋卷曲结构位于 221aa-290aa 范围内，可能介导了 P 蛋白四聚体的形成以及与 L 蛋白的相互作用：预测 NDV 的 X 结构域位于291aa-392aa 范围内，其中 350aa-392aa 区域内存在 3 个相连的 -螺旋，其二级结构与副粘病毒 X 结构域的 C 端亚单位结构相似，可能介导了 P 蛋白与衣壳化基因组的相互作用。V 蛋白的
20、 C 端结构域(C-terminaldomain，CTD)的编码区域位于 P 蛋白 132aa-239aa 区域内，与螺旋卷曲结构部分重叠。最后，根据分析结果将基因 VII 型 NDV 毒株 ZJ1V 蛋白 CTD 的序列插入 pGEX-6p-1 表达载体中诱导表达。表达产物通过切胶免疫的方法多次免疫小鼠，结果获得抗 V 蛋白CTD 的多抗血清。利用间接免疫荧光鉴定多抗血清与病毒蛋白的反应情况，证明制备的抗 CTD 血清能够与 NDV 感染 vero 细胞作用，与正常 Vero 细胞不反应，为后续的研究工作奠定了基础。 3.不同基因型新城疫病毒 P 基因对病毒毒力的影响 利用 BglII 酶切
21、全长质粒 pNDV/ZJ1，成功构建含有 TVT 载体、NP 基因、P 基因以及很少部分 M 基因和 L 基因片段的中间质粒 pTX37。PCR 分别分别扩增 NDV 基因 II 型疫苗株 LaSota、基因 III 型中等毒力株 JS/05/9/Go 和基因VII 型强毒株 JS/05/5/Go 的 P 基因，上游引物突变引入 SmaI 的酶切位点，下游引物突变出 ApaI 酶切位点。通过 SmaI 和 ApaI 将 3 株病毒的 P 基因替换进入中间载体 pTX37，再利用 Bst217I 和 XbaI 将重组质粒连入 NDV 基因组全长转录载体质粒。重组的 3 种 NDV 基因组全长转录
22、载体质粒与 3 个辅助表达质粒 pCI-L、pCI-NP 和 pCI-P 共转染 BSR-T7/5 细胞，成功拯救出了 P 基因替换株 RZJ-LP，RZJ-4P，RZJ-IP。通过 MDT、ICPI、IVPI、细胞致病力以及生长曲线的检测，发现 3 株 P 基因替换株的毒力变现明显的差异：RZJ-LP 和 RZJ-4P 在细胞上的生长滞后于亲本病毒 ZJ1，细胞上清中的病毒含量比 ZJ1 低 10 倍左右；RZJ-4P 和 RZJ-LP 的 ICPI 从 ZJ1 的 2.54 下降至 2.33 和 1.51；RZJ-IP 表现出了比 ZJ1 更强的感染力，感染细胞后最早出现病变的时间和完全破
23、坏单层细胞的时间比 ZJ1 还要早 12h-24h。3 株 P 基因替换株的毒力强弱排序与其 P 基因来源毒株的毒力强弱排序相同，表明 P 基因是影响 NDV 毒力的因素之一。 4.新城疫病毒 P 基因编码产物的结构域对病毒生物学活性的影响 通过 SmaI 和ApaI 的酶切位点，将基因 II 型疫苗株 LaSotaP 基因 RNA 编辑位点上游部分和下游部分分别替换进入基因 VII 型 NDVZJ1，成功拯救了具有嵌合 P 基因的两株重组病毒 RZJ-LaN 和 RZJ-LaC。通过 PCR 在中间质粒 pTX37 的 P 基因 RNA 编辑位点后进行点突变引入终止密码子 TAG，拯救 V
24、蛋白 C 端结构域缺失株 RZJ-VS和荧光标记的 RZJ-VS/GFP，重组病毒 P 蛋白的正常表达不受影响，而由+1GmRNA 编码的 V 蛋白翻译到 RNA 编辑位点后即终止。通过 MDT、ICPI、IVPI、细胞致病力以及生长曲线的检测，发现 RZJ-LaN 和 RZJ-LaC 的毒力比亲本病毒稍弱，但明显强于 P 基因替换株 RZJ-LP，表明上一章中发现的 RZJ-LP 毒力大幅度下降是由 P 蛋白和 V 蛋白的多个结构域协同作用的结果，并非是单个结构域导致。在没有干扰素系统的 Vero 细胞上 RZJ-LP、RZJ-LaN 和 RZJ-LaC 生长曲线基本重合，而在原代细胞 CE
25、F、GEF 上 RZJ-LaN 的增殖能力最强，RZJ-LaC 最弱，RZJ-LaN 感染细胞中病毒的最高含量比 RZJ-LP 高 510 倍，RZJ-LP 比RZJ-LaC 高 510 倍，表明 ZJ1V 蛋白 CTD 的干扰素拮抗能力强于 LaSota。V 蛋白缺失株的生物学活性与相关报道完全相反，在细胞和鸡胚中的生长不受影响，接种 Vero、CEF 和 GEF 细胞以后，细胞病变以圆缩脱落为主，单层细胞完全破环的时间超过 72h。这种细胞病变过程与亲本病毒完全不同，暗示 V 蛋白的 CTD结构域应该具有未知的功能。检测荧光发现，RZJ-VS/GFP 和 RZJ/GFP 在以0.01MOI
26、 接种细胞后 12h 都出现了很强的荧光，24h 后绝大多数单层细胞出现荧光，这表明 ZJ1 株的复制和传播能力非常的强，感染速度超过了细胞抗病毒免疫启动的速度，推测基因 VII 型 NDV 高效的增殖和传播能力也是其免疫逃避的机制之一 全文小结： (1)测定了 2 株基因 III 型和 5 株基因 IX 型 NDV 的全基因组序列，证实两种基因型毒株虽然同源性较高，但是基因 IX 型 NDV 确实有 6nt 插入片段，基因全长为 15，192nt，是最早出现的 15，192nt 基因组长度毒株。分析后推测，NDV 毒株在遗传进化过程中分化为两支，保持 15，186nt基因组长度的一支演变为基
27、因 III 型、IV 型及相关毒株；而另外一支，在 NP基因中插入 6 个核苷酸，产生了 15，192nt 基因组长度的毒株，可能即为最早的基因 IX 型毒株，再逐步进化演变为后来的基因 VVIII 型。 (2)通过对 P基因表达产物的生物信息学分析，确定 P 蛋白和 V 蛋白结构域的大致位置。 (3)通过反向遗传平台，替换基因 VII 型强毒 ZJ1 的 P 基因全基因或部分结构域，成功拯救 5 株重组病毒。3 株 P 基因替换株的毒力强弱排序与其 P 基因来源毒株的毒力强弱排序相同，证实 P 基因是影响毒力的因素之一，同时发现 P 基因对毒力的影响是由多个结构域共同参与，而非单一结构域决定
28、。 (4)利用反向遗传平台，成功拯救 2 株 V 蛋白 C 端结构域缺失病毒，证实在相同病毒骨架下，ZJIV 蛋白的干扰素拮抗能力强于 LaSota。V 蛋白 C 端结构域缺失株的生物学特性与亲本病毒差异不大，明显与 NDV 同类研究结果相反，推测基因 VII 型NDV 高效的增殖和感染能力也是其免疫逃避机制之一。 (5)细胞感染 RZJ-VS以后，CPE 明显改变，细胞以圆缩脱落为主，单层细胞完全破环的时间大幅度延长，暗示 V 蛋白的 C 端结构域应该具有未知的功能。新城疫(Newcastledisease，ND)是一种严重的传染性疾病，能够感染多种禽类，给世界养禽业造成了巨大的损失。测定了
29、鹅源 NDV 强毒株 ZJ1 的全基因组序列，并在此基础上构建了该基因组 cDNA 的全长克隆以及分别表达该毒株 NP、P 以及L 蛋白的 3 个真核表达质粒，通过病毒的体外包装技术，拯救出了具有感染性的病毒粒子，成功建立了鹅源 NDV 的反向遗传操作技术平台，这也为从病毒生物学特性的角度研究 P 基因提供了技术支持。 1.基因 III 型和 IX 型新城疫病毒全基因组测序及其在新城疫进化史中的重要地位分析 根据EMBL/GenBank 中已发表的基因 III 型 NDV 全基因和基因 IX 型 NDV 基因片段设计一套全基因引物，将 NDV 全基因分为 10 个相互重叠的片段进行 RT-PC
30、R 扩增。PCR 产物连入 pGEM-Teasy 载体测序后应用 DNAStar 软件进行遗传进化分析。我们测定了 5 株基因 IX 型 NDV 和 2 株基因 III 型全基因组序列并进行遗传进化分析。实验数据显示，虽然两种基因型毒株同源性较高，但是基因 IX 型 NDVNP 基因内确实存在 6nt 插入片段，特别提醒 ：正文内容由 PDF 文件转码生成，如您电脑未有相应转换码，则无法显示正文内容，请您下载相应软件，下载地址为 http:/ 。如还不能显示，可以联系我 q q 1627550258 ，提供原格式文档。“垐垯櫃 换烫梯葺铑?endstreamendobj2x 滌?U 閩 AZ箾
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