1、目 录第 1 章 前言 11.1 多糖11.1.1 多糖概述11.1.2 多糖提取11.1.3 多糖分离41.1.5 多糖纯度及相对分子质量的测定51.1.6 多糖结构分析61.1.7 多糖生物活性61.2 本课题立题背景、研究意义及主要研究内容91.2.1 立题背景、研究意义91.2.2 研究内容10第 2 章 虎眼万年青和刺五加多糖的提取工艺研究.122.1 实验材料122.1.1 原料122.1.2 试剂122.1.3 仪器122.2 实验方法122.2.1 多糖含量测定方法122.2.2 虎眼万年青多糖提取工艺考察142.2.3 刺五加多糖提取工艺考察152.3 结果与讨论152.3.
2、1 虎眼万年青多糖提取工艺152.3.2 刺五加多糖提取工艺262.4 小结34第 3 章虎眼万年青和刺五加多糖的分离纯化及理化性质分析.363.1 实验材料363.1.1 原料363.1.2 试剂363.1.3 仪器363.2 实验方法373.2.1 虎眼万年青和刺五加多糖分离纯化工艺流程373.2.2 分级沉淀373.2.3 除蛋白质383.2.4 脱色383.2.5 透析383.2.6 离子交换柱层析393.2.7 凝胶过滤柱层析393.2.8 纯度鉴定403.2.9 一般物理性质分析413.2.10 多糖及糖醛酸含量测定413.2.11 分子量测定423.3 结果与讨论423.3.1
3、分级醇沉结果423.3.2DEAE Sepharose Fast Flow 柱层析分离结果 .433.3.3 Sephadex G-75 柱层析结果 453.3.4 纯度鉴定结果453.3.5 一般物理性质分析结果463.3.6 多糖及糖醛酸含量测定463.3.7 分子量测定结果分析473.4 小结47第 4 章 虎眼万年青和刺五加多糖的结构初步分析.484.1 原料、仪器与试剂484.1.1 供试材料484.1.2 仪器484.1.3 试剂484.2 实验方法484.2.1 红外光谱分析484.2.2 单糖组成分析494.3 结果与讨论504.3.1 红外光谱分析504.3.2 GC-MS
4、测定单糖组成结果 514.3.3 毛细管电泳测定单糖组成结果524.4 小结54第 5 章 虎眼万年青和刺五加多糖活性研究.555.1 仪器及药品555.2 实验方法555.2.1 总抗氧化活性测定555.2.2 对羟基自由基的清除作用565.2.3 对 O2-抑制作用 .565.2.4 对有机自由基 DPPH 的清除作用 .565.2.5 对脾细胞增殖的影响575.3 结果与讨论585.3.1 多糖总抗氧化活性测定结果585.3.2 对羟基自由基的清除作用测定结果595.3.3 对 O2-抑制作用测定结果 .615.3.4 多糖对有机自由基 DPPH的清除作用结果 .625.3.5 多糖对脾
5、细胞增殖影响测定结果635.4 小结65参考文献.66致谢.72攻读学位期间研究成果.73中文 摘要 .I英文摘要 .III长春师范学院硕士学位论文0第 1 章 前言1.1 多糖1.1.1 多糖概述多糖又称多聚糖，是由多个单糖基及糖苷键相连接而形成的高聚物，一般是由 20个以上的单糖聚合而成，广泛存在于动物细胞膜、高等 植物和微生物的细胞壁中，是构成生命的四大基本物质之一，与维持生命活动密切相关。蛋白质、核酸和多糖是重要的生物大分子，由于多糖的结构难以控制，再加上人们早期只是把多糖看作细胞结构成分和食物来源，使得人们对多糖的研究成为“ 生物化学中最后一个前言” 。目前，以多糖结构、功能和药用价
6、值为核心的糖工程被认为是继蛋白质工程、基因工程之后生物化学和分子生物学领域中最后一个巨大的科学前沿 1-4。至今，几百种天然多糖的发现已给人类提供了丰富的生物多聚体的宝库。多糖不但是动植物的主要结构支持物质（如甲壳动物中的几丁质、植物中的纤维素） ，而且也是生物体的主要能量来源（如淀粉、糖原） ，同时多糖也是工业上重要多聚体的原料来源（如食品工业上不可缺少的卡拉胶，工业上应用的田菁胶等等） 。不但如此，多糖还具有复杂的多方面的生物活性与功能，多糖的糖链能控制细胞的分裂与分化，调节细胞的生长与衰老，特别是多糖作为广谱免疫调节剂在免疫疾病治疗上的应用 5。现在国际上多糖研究以日本、美国、德国和加拿
7、大处于领先地位，我国多糖的研究虽然起步较晚，但在全国第一次糖的生化学术会议后， 糖复合物的生化研究技术的出版，标志着我国在糖化学方面的研究工作已经有了一个较好的开端。1996 年我国将“糖生物学 ”列为国家重点课题。研究对象包括植物类、动物类、真菌类、细菌等。研究范围涉及多糖的分离纯化、理化性质、结构分析、免疫学、药理学以及临床应用等。经过半个多世纪的发展，活性多糖的研究取得了重大进展，建立了一系列活性多糖的提取、纯化方法、生物活性测试方法、结构分析方法，发现了许多具有重要生理活性的多糖，研究的广度和深度在不断的发展。随着多糖化学和多糖生物学的深入研究，活性多糖将会进入一个新的时代，将为人类的
8、健康和安全提供更为有力的帮助。1.1.2 多糖提取多糖作为一大类天然产物，广泛存在于植物、动物、微生物中，提取多糖之前，首先要根据多糖的存在方式及提取部位的不同，决定是否作预处理。动物多糖和微生物的胞内多糖多有脂质包围，一般需先加入醇或醚进行回流脱脂，然后再依多糖的性质采用冷水、热水、冷或热的氢氧化钠、乙酸或苯酚等溶液提取。由于植物细胞壁比较牢固，因此在提取前需进行专门的破细胞操作，包括机械破碎(研磨法、组织捣碎法、长春师范学院硕士学位论文1超声波法、压榨法、冻融法)、溶胀和自胀、化学处理和生物酶降解等 6。目前，多糖的提取方法有溶剂浸提法、酶法、超滤法、超声辅助提取法、微波辅助提取法和超临界
9、流体萃取法等。1.1.2.1 溶剂提取法溶剂提取法是提取多糖的常用方法，就是利用相似相溶的原理，选用合适溶剂从原材料中把所需要的有效成分溶解出来，而对其它成分不溶或少溶。多糖是极性大分子化合物，应选择水、酸 7、碱 8、醇等极性强的溶剂。在所有溶剂中，水是典型的强极性溶剂，对植物组织的穿透力强，提取率高，并且安全无毒，因此被广泛应用。影响提取率的因素除了溶剂的种类外，还有提取温度、提取时间、溶剂的用量以及物料的粒度等，因此应根据提取目标物，综合考虑，选择适宜的溶剂、提取温度、提取时间、溶剂用量等。用水作溶剂来提取多糖时，为了提高提取率和缩短提取时间，通常采用热水浸煮提取，得到的多糖多数是中性多
10、糖。1.1.2.2 超声辅助提取法超声辅助提取中药材的优越性，是基于超声波的特殊物理性质。主要是通过压电换能器产生的快速机械振动波来减少目标萃取物与样品基体之间的作用力从而实现固-液萃取分离。(1) 加速介质质点运动：在高于 20KHz 声波频率的超声波的连续介质(例如水) 中传播时，根据惠更斯波动原理，在其传播的波阵面上将引起介质质点（包括药材重要有效成分的质点）的运动，使介质质点运动获得巨大的加速度和动能。质点的加速度经计算一般可达重力加速度的二千倍以上。由于介质质点将超声波能量作用于药材中药效成分质点上而使之获得巨大的加速度和动能，迅速逸出药材基体而游离于水中。(2)空化作用：超声空化是
11、指液体中的微小泡核在超声波作用下被激活，进而表现为泡核的振荡、生长、收缩乃至崩溃等一系列过程。空化泡破裂时吸收的声场能量能在极短的时间和狭小的空间内释放出来，形成高温和高压的环境，同时伴随着强大的冲击波和微声波，从而破坏细胞壁结构，使其瞬间破裂，胞内有效成份得以释放，直接进入溶剂并充分混合，从而提高多糖提取率。与常规提取法相比，超声波提取可缩短提取时间，提高提取率 9-11，所以在多糖的提取中得到了广泛的应用。值得注意的是，超声法提取多糖时，超声时间不宜过长，因为超声波具有较强的剪切作用，长时间的作用会使大分子的多糖断裂，从而在后处理的过程中的损失增大而影响多糖的提取率 12。1.1.2.3
12、复合酶法除传统的热水浸提外，现在有的采用酶法提取多糖 13-16，即采用复合酶-热水浸提相结合的方法，通过酶反应将原料组织分解，加速有效成分的释放和提取，选择适宜条件将影响提取的杂质分解去除，促进某些极性低的脂溶性成分转化成糖类易溶于水的成分，降低提取的难度，具有条件温和、易去除杂质、回收率高和降低能耗等优点，因此，酶法提取的应用前景十分广阔。由于酶具有专一性和选择性的特点，应用时多长春师范学院硕士学位论文2采用复合酶。需要注意的是一组酶之间的协同关系、底物、抑制剂和酶的浓度，还要注意酶解设备与工艺参数，如粉碎、粉碎设备、pH 、温度和时间等。1.1.2.4 微波辅助提取法在快速振动的微波电磁
13、场中，被辐射的极性物质分子吸收电磁能，以每秒数十亿次的高速振动产生热能 17-18。微波提取过程中，微波辐射导致植物细胞内的极性物质，尤其是水分子吸收微波能，产生大量热量，使细胞内温度迅速上升，液态水汽化产生的压力将细胞膜和细胞壁冲破，形成微小的孔洞，进一步加热，导致细胞内部和细胞壁水分减小，细胞收缩，表面出现裂纹。由于孔洞和裂纹的存在，胞外溶剂容易进入细胞内，溶解并释放胞内多糖。微波的频率很高，能深入渗透物体，对细胞的结构有较大作用。微波加热的热效率高，温度升高快速而均匀，因此，应用微波加热提取手段，能够显著缩短萃取时间，较大程度地提高多糖的萃取效率。1.1.2.5 超滤提取法超滤是一种膜分
14、离技术，所用的超滤膜能够从水和其它液体中分离出很少的大分子。超滤膜具有不对称微孔结构，且采用摩擦流道和湍流促进结构，使得在分离过程中大分子溶质和微粒(如胶体、淀粉等)随溶液切向流经膜表面，而小分子物质和溶剂则在压力驱动下穿过致密层上的微孔进入膜的另一侧。超滤膜可以长期连续使用并保持较恒定的产量和分离效果，将超滤用于多糖这种生物活性物质的分离 19-21，具有保护活性、分离效率高、能耗低、设备简单、可连续生产、无污染等优点。1.1.2.6 超临界流体萃取法超临界流体（Supercritical Fluid，SCF ）萃取技术中的 SCF 是指温度和压力均高于临界点的流体，如二氧化碳、氨、乙烯、丙
15、烷、丙烯、水等。高于临界温度和临界压力而接近临界点的状态称为超临界状态。处于超临界状态时，气液两相性质非常相近，以至无法分别，所以称之为 SCF。超临界流体萃取分离过程是利用超临界流体的溶解能力与其密度的关系，即利用压力和温度对超临界流体溶解能力的影响而进行的。当气体处于超临界状态时，成为性质介于液体和气体之间的单一相态，具有和液体相近的密度，粘度虽高于气体但明显低于液体，扩散系数为液体的 10100 倍，因此对物料有较好的渗透性和较强的溶解能力，能够将物料中某些成分提取出来。超临界流体萃取具有提取率高、产品纯度好、流程简单、能耗低等优点，是提取分离领域中目前最为先进的方法。目前，常用的超临界
16、流体为 CO2，廖周坤等 22采用超临界 CO2 萃取装置，从藏药雪灵芝中萃取多糖类成分，结果发现超临界 CO2 萃取与传统的溶剂萃取工艺相比，多糖类成分的收率可以提高到原来的 1.62 倍。多糖的提取从传统的溶剂萃取法到酶法、超声强化法、微波辅助法以及超临界CO2 萃取技术的应用，总体来说，提取的多糖的纯度有所提高，提取条件的要求也逐渐苛刻，对应的预处理要求和提取成本也就有所提高。对于不同的多糖，要根据其要求和具备的条件，采用不同的提取方法和预处理方法。为了达到最好的提取效果，可长春师范学院硕士学位论文3以将几种提取方法配合使用，如超声-微波协同萃取法 23、超声波-酶法 24等。1.1.3
17、 多糖分离1.1.3.1 除蛋白质Savage 法 根据蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性的特点，用氯仿：戊醇(或正丁醇)5： 1 或 4： 1，混合物剧烈振摇 2030 min，蛋白质与氯仿-戊醇(或正丁醇)生成凝胶物而分离，离心，分去水层和溶剂层交界处的变性蛋白质。此种方法的优点是条件温和，不会引起多糖的变性，缺点是效率低，要经过多次反复才能将蛋白除尽，同时会消耗大量的有机溶剂。如能配合加入一些蛋白质水解酶，再用 Savage 法效果更佳 25-26。三氯醋酸法 在多糖水溶液中滴加 3%三氯醋酸，直至溶液不再混浊为止，在510 放置过夜，离心除去沉淀，即得不含蛋白的多糖溶液。此法较为强烈，往往引
18、起某些多糖的降解 27。三氟三氯乙烷法 多糖溶液与三氟三氯乙烷等体积混合，低温下搅拌 10 min 左右，离心得上层水层，水层继续用上述方法处理几次，即得无蛋白质的多糖溶液，此法效率高，但溶剂沸点较低，易挥发，不宜大量应用。1.1.3.2 脱色素多糖中常含有一些色素(游离色素或结合色素)，根据其不同性质采取不同的方法。常用的脱色方法有：离子交换法 28、氧化法 29、金属络合物法、吸附法(纤维素、硅藻土、高龄土、活性炭等) 30-34。其中，最常用的是双氧水脱色法 35和活性炭脱色法 36，双氧水脱色法：利用双氧水的氧化作用在 5060 对多糖中的色素物质进行降解，使色素产生的颜色得以脱去，但
19、反应条件较剧烈，温度、时间须控制良好，以防止高温长时间下多糖的降解。由于双氧水脱色方法是提取液中直接氧化其中的色素，并未脱除，因此，氧化后的色素仍然作为杂质留在提取液内，并不能保证其最后品质。活性炭脱色法：利用活性炭对色素的吸附作用进行脱色。活性炭为黑色细微粉末，无臭，无味，具有无毒、脱色脱臭效果良好的特点，可以反复使用，成本低。但其用量、温度、时间等反应条件须经试验才能得到最好效果。但是活性炭对物质的吸附属于纯物理吸附，特异性差，大多文献记载了使用活性炭的浓度范围在配制量的 0.21%之间。而活性炭脱色后，色素便被分离出来，从而提高了粗多糖的纯度，因而是一种较可取的脱色方法，但同时导致多糖损
20、失量大。对于同时含有游离蛋白质和色素的多糖，可通过生成金属络合物的方法，同时除去蛋白和色素。方法是加入费林试剂生成不溶性络合物，经分离后用阴离子交换树脂分解络合物。吸附脱色法也常用，如通过活性炭、高岭土、硅藻土达到纯化的目的1.1.3.3 小分子杂质的去除多糖提取液中有许多低聚糖等小分子杂质，可通过逆向流水透析法除去。对于无长春师范学院硕士学位论文4机盐及低分子量的有机物质，可用透析法、离子交换树脂或凝胶过滤法、纤维素膜超滤等方法除去。如用 Sephadex G-25 以达到去离子作用，本法比较简单，但是增大了溶液的体积，影响多糖的沉淀结果。纤维素膜超滤法是根据膜技术而新发展起来的，以这种方式
21、对大多数样品进行浓缩速度很快，而且温和，所以即使发生失活也是很小的。利用不同孔径的膜有可能使大小不同的分子分级，但这个方法的分辨率要比分子筛层析可能达到的小得多。1.1.4 多糖纯化经过脱蛋白、脱色和去除小分子杂质的提取液是含多种组分的多糖混合物，要想得到单一多糖组分，还需要进行纯化。目前多糖的纯化方法有以下几种：分步沉淀法 37：不同多糖在不同浓度的低级醇或酮中具有不同溶解度，按比例由小到大加入这些醇或酮( 常用甲醇、乙醇和丙酮)分部沉淀。 季铵盐沉淀法 38：酸性多糖能与其成盐形成不溶性化合物，可分离酸性及中性多糖。常用的季胺盐是十六烷基三甲基溴化铵和十六烷基吡啶。金属络合法：根据不同多糖
22、能与 Cu2+、Ca 2+、Pb 2+、Ba 2+形成不溶性络合物而沉淀的性质。常用的络合剂有：菲林溶液、氯化铜、氢氧化钡和醋酸铅等。得到的络合物沉淀经水充分洗涤后，用 5%无机酸乙醇液或硫化氢分解。盐析法：在溶液中加入醋酸铅除去大部分酚类和酸性杂质，如有机酸、氨基酸、蛋白质、鞣质、黄酮、蒽醌、酸性多糖等。若用碱式醋酸铅沉淀，则多糖的沉淀更完全。除去杂质后的母液用 H2S 脱铅后，单糖、低聚糖及水溶性大的中性苷类仍留在溶液中。纤维素阴离子交换柱层析法：常用交换剂为树脂类、纤维素类和葡聚糖类。其中，阴离子交换柱层析法适合于分离各种酸性、中性及粘多糖。pH 为 6 时，酸性多糖吸附于交换剂上，中性
23、多糖不吸附，然后用不同离子强度的缓冲液按酸性强弱将各种多糖依次洗脱，洗脱方式可以是阶梯式或梯度式。若 pH 为碱性，中性多糖也能吸附。中性多糖还能与硼砂形成络合物，若将柱处理成硼砂型后，改变硼砂液浓度也能将不同中性多糖洗脱下来。另外，杂质会吸附于柱上端而达到部分纯化的目的。多糖在柱上的吸附力与其结构有关，吸附力一般随分子中酸性基团的增加而增大。对于线性分子，分子量大的比小的易吸附，直链多糖比分枝多糖易吸附。阴离子交换柱层析法适合于分离各种酸性、中性多糖和粘多糖。吸附力一般随多糖分子中酸性基团的增加而增加。凝胶柱层析法：根据多糖分子的大小和形状不同进行分离。常用的凝胶有葡聚糖凝胶(Sephade
24、x)及琼脂糖凝胶 (Sepharose)。此外还有制备性高效液相层析、制备性区带电泳、超过滤法以及亲和层析等，但多数采用 DEAE 纤维素柱层析和葡聚糖凝胶柱层析进行纯化。1.1.5 多糖纯度及相对分子质量的测定近年来,高压电泳法是纯度鉴定的常用方法。电泳的支持物可用纸、醋酸、纤维素膜。其他如聚丙烯酰胺凝胶电泳、琼脂糖电泳、凝胶柱层析、气相色谱及浊度滴定、长春师范学院硕士学位论文5比旋光度法等方法也可用于纯度鉴定。目前常用的测定分子量方法有很多报道，分子量小于 20000 Da，用蒸汽压渗透法及动态渗透法，分子量 20000-50000 Da 者可用溶液渗透压法，还有超离心法。粘度大的多糖可用
25、粘度法。另外超过滤法，还原端法及聚合度法。这些方法操作复杂且误差较大，目前较常用的方法有凝胶过滤法和高效液相色谱法，其中以凝胶过滤法最简便可用，它是将充分膨胀好的 Sephadex G-200、Sephadex G-150 或 Sephadex G-75 湿法装柱，用一定离子强度的氯化钠水溶液进行平衡，然后将各种不同的已知分子量的多糖分别相继上柱，同一离子强度的氯化纳水溶液洗脱，分步收集，苯酚-硫酸法监测，分别求得洗脱体积 Ve，然后再将蓝葡聚糖(MW200 万 )上同一条柱，求出柱的空体积 V0，根据 Ve/V0 与 logM 之间存在着线性关系，可绘制标准曲线。最后，将待测样品按上述不变的
26、条件上柱，求得待测多糖的Ve。通过标准曲线上的 Ve/V0，查得待测多糖的分子量对数，便可求出 M。1.1.6 多糖结构分析多糖的结构分析是多糖化学研究的关键，完整的多糖结构分析包括对多糖的一级结构和高级结构的分析。多糖结构的描述包括分子量范围、单糖的组成、连接点类型、单糖和糖苷键的构型及重复单元等。多糖的结构研究目前还多集中于一级结构的测定，这与多糖分子结构的复杂性和仪器检测的水平有关。目前已经形成的多糖一级结构的分析方法可以分为三大类，即化学分析法、仪器分析法和生物学方法。化学分析方法包括酸水解法、高碘酸氧化、Smith 降解、甲基化反应以及乙酞解等；仪器分析法包括紫外光谱法(UV)、红外
27、光谱法(IR) 、气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC) 、质谱法(MS) 、核磁共振波谱法(NMR)、圆二色谱法(CD) 、电泳法等；生物学方法包括酶学方法、免疫学方法等。多糖结构分析方法很多，但迄今还没有一种方法可以单独完成，只有将各种方法彼此结合起来才能完成多糖结构的分析。1.1.7 多糖生物活性多糖是一类天然高分子化合物，是一切有生命的有机体必不可少的成分，同维持生物机能密切相关。经过多年来的大量研究证明，多糖具有广泛的生物活性，如免疫调节、抗肿瘤、抗感染、抗凝血、抗病毒、抗细菌、抗辐射、抗氧化、降血糖、降血脂、促进核酸与蛋白质的生物合成、控制细胞分裂和分化、调节细胞的生长与衰
28、老等。1.1.7.1 抗肿瘤活性多糖具有较强抗肿瘤作用，已经成为肿瘤治疗的研究热点之一。自从 50 年代发现酵母多糖具有抗肿瘤效应以来，已分离出了许多具有抗肿瘤活性的多糖。按照抗肿瘤作用机理，可将抗肿瘤多糖分为两大类：一类是具有细胞毒性的多糖直接杀死了肿瘤细胞；另一类是作为生物免疫反应调节剂，通过增强机体的免疫功能而间接抑制或杀长春师范学院硕士学位论文6死肿瘤细胞的(也就是常说的宿主介导抗肿瘤活性)，具有抗肿瘤活性的大多数多糖都是通过这种途径起作用的 39。研究发现，牛膝多糖能够激活 NKC 和 T 细胞，抑制实体瘤 40；当归多糖可以阻滞 HL-60，K 562 细胞生长 41；芦荟多糖可以
29、增强 TAK 细胞的繁殖能力，增加 TAK 细胞和 IR-2R 的表达 42。1.1.7.2 免疫调节作用免疫调节作用是多糖的最重要的作用之一，多糖的许多功效都与其提高免疫作用有关。作为一种免疫调节剂，多糖主要通过诱生多种细胞因子，促进干扰素、白细胞介素等的产生，激活巨噬细胞、自然杀伤细胞、淋巴细胞等免疫细胞，激活网状内皮系统和补体系统及促进抗体产生等多途径、多层面来提高机体特异性和非特异性免疫功能，从而发挥其对免疫功能的多方面调节作用 43。紫松果菊 44中分离的多糖与小鼠骨髓中的巨噬细胞共同孵育，则巨噬细胞对肿瘤细胞的毒性被大大激活，这是由于该多糖可促进巨噬细胞产生肿瘤坏死因子 (TNF-
30、 )和干扰素 (IFN- )，从而增强对肿瘤细胞株的细胞毒性。此外，银耳多糖 45、蜜环菌多糖 46、刺五加多糖 47、褐藻糖胶多糖 48、云芝多糖 49、淫羊霍多糖 50等都能显著增强腹腔巨噬细胞的吞噬功能。香菇多糖 51可促进正常小鼠由 ConA 刺激的脾脏 T 淋巴细胞增殖反应并纠正由环磷酰胺诱导的免疫亢进或低下状态。芦荟粗多糖 52具有促进体外表皮细胞增殖和保护表皮细胞的作用,并可能通过调节细胞内 Ca2+来发挥其促进细胞增殖作用。1.1.7.3 抗病毒活性大量研究表明，许多多糖对各种病毒有抑制作用，如艾滋病毒(HIV-1)、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、流感病毒、囊状胃炎病毒、劳斯肉瘤病
31、毒、乌肉瘤病毒。从杜氏藻总多糖中分离得到的天然硫酸多糖 PDS253，具有抗病毒作用， 0.0063 mg/mL 时即能抑制流感病毒引起的 CPE；香菇多糖 54对流感病毒有一定的抑制作用，对病毒感染细胞的保护率可达 95.6%；不同浓度的松子壳多糖 55均可不同程度地抑制病毒的致细胞病变作用，松子壳多糖最低质量浓度 31.2 mg/L 仍具有抗病毒作用，细胞存活率均在49.08%以上；板蓝根多糖 56体外对 PRRSV 具有较好的阻断和抑制作用，其最小阻断浓度为 2.094 g/mL，最小抑制浓度为 8.375 g/mL。目前，研究较多的硫酸化多糖 57-66，在临床上有所应用，如抗艾滋病药
32、物 Hoe/Bay 946、猪苓多糖等。硫酸化多糖在临床应用的主要障碍在于它们的强阴离子性及抗凝血活性 67-70，因而会产生副作用。1.1.7.4 抗衰老活性衰老与机体免疫系统密切有关，随年龄增大，免疫功能下降或紊乱，胸腺萎缩，T 细胞损耗，从而导致衰老。多糖能从整体上提高机体免疫能力，从一定程度上延缓衰老，防治老年病。许彬等 71研究发现，竹节参多糖可通过小鼠调节机体免疫功能、清除自由基等方面发挥其延缓衰老的作用；林晓等 72观察灵芝多糖抗老年大鼠皮肤衰老作用，发现灵芝多糖提高羟脯氨酸和 SOD 含量呈剂量依赖性，灵芝多糖提取物可有效缓解皮肤衰老。此外，肉苁蓉多糖 73、当归多糖 74、山
33、茱萸多糖 75、海带多糖 76、长春师范学院硕士学位论文7党参多糖 77、马齿苋多糖 78等都具有一定的抗衰老作用。1.1.7.5 抗凝血活性多糖抗凝血的机制可能有两种：一是同抗凝血酶结合，诱导其改变构型，从而将其激活；二是对一种血清蛋白酶抑制因子(肝素辅因子)的激活。施松善等 79通过口服和尾静脉注射两种给药方式给药考察长叶蜈蚣藻多糖(GLP)的抗凝血作用，发现 GLP静脉注射和口服均具有较好的抗凝血活性；茶多糖 80具有抗凝血作用，能显著延长人体血浆的 APTT 值，而对 TT 和 PT 值无明显影响；羊栖菜硫酸多糖 81F1 与抗凝血效果有显著的量效关系。1.1.7.6 抗辐射活性随着科
34、技发展和生活现代化，人们接触射线的时候越来越多，而射线的辐射性对人体有很大的损伤。研究表明，黑木耳多糖 82具有抗辐射作用，可提高 60Co 照射动物的存活率；阿魏菇多糖和枸杞多糖 83对 辐射产生的自由基所造成的鼠肝线粒体细胞膜伤害具有良好的抗氧化抑制效果；螺旋藻多糖 84除能增加骨髓细胞的增殖活性外，还能显著减轻小鼠骨髓细胞和蚕豆根尖细胞的辐射遗传损伤，大大降低辐射引起的突变频率。1.1.7.7 抗炎活性当机体感染细菌后，多种炎症介质迅速释放，包括肿瘤坏死因子- (TNF- )、白细胞介素-1(IL-1) 、白细胞介素-6(IL-6) 、白细胞介素 -8(IL-8)，数小时后，各种抗炎症因
35、子产生，如白细胞介素-10(IL-10)、单核细胞趋化因子-l(MCP-l)等，以对抗炎症反应。此外，这些细胞因子能够直接抑制炎症因子的生成或促进特定细胞因子抑制剂(如 IL-1受体、可溶性 TNF 受体)的合成，同时也可下调趋化因子及其受体和 Thl 细胞因子(如IL-2、 INF- )的水平。微生物来源的多糖 139A 对小鼠角叉菜胶关节肿胀有明显抑制作用，对佐剂型关节炎、多发性关节炎有明显预防作用，它是通过抑制免疫细胞因子 IL-1 来达到消炎作用 85。知母多糖能显著抑制角叉菜胶致大鼠足趾肿胀及大鼠棉球性肉芽肿增生动物模型的炎症反应，其抗炎作用通过促进肾上腺素分泌较高水平的糖皮质激素及
36、抑制炎症组织 PGE 的合成或释放实现 86。1.1.7.8 降血糖活性近年来，糖尿病已成为全世界发病率和死亡率最高的五种疾病之一，因此降血糖药物的研究成为人们关注的热点。石雪萍等 87对苦瓜水溶性粗多糖的降血糖活性进行研究，结果表明苦瓜水溶性多糖能够明显降低糖尿病小鼠的血糖，剂量 500 mg/kg 时，效果超出甲糖宁；王元凤等 88比较绿茶中不同溶剂分级提取的茶多糖的降血糖活性的差异，降血糖活性顺序为：TPSTPS TPS，但 TPS得率最低，昆明种小鼠灌胃以螺旋藻多糖（PSP ） 89 10.0 mg/ kg，20.0 mg/kg，连续 10 d，结果提示 PSP 具有一定的降血糖活性。
37、长春师范学院硕士学位论文81.1.7.9 抗氧化活性自由基是生物体新陈代谢过程中产生的一类可以单独存在的具有高度氧化活性的带有一个或几个不配对电子的分子或原子，包括超氧阴离子自由基( .O2-)、羟基自由基(.OH)和脂基自由基(ROO .)等。在正常情况下，人体内的自由基处于动态平衡中，但是一旦该平衡被打破，就会对机体造成伤害，从而引发一系列相关疾病。来源于纯天然植物等的多糖具有低毒、安全等特点，抗氧化多糖的发现，无疑为氧化损伤相关疾病的治疗带来了新的希望。目前，对天然产物中抗氧化多糖的研究较多，如，孟良玉等 90发现，枸杞多糖具有显著的抗氧化性，对化学反应生成的活性氧自由基具有较好的清除作
38、用。胡可等人91发现，苦瓜多糖溶液对有机自由基和超氧离子具有显著清除作用，清除率随多糖溶液浓度的增加而提高，存在最适浓度，在某些条件下接近 100%；宋灿等 92研究发现，香蕉皮多糖清除 DPPH 自由基的能力随着浓度的增加而增加，其中 2.0 mg/mL 的多糖样品对 DPPH.自由基的清除率达 76.2%，相当于 10 g/mL的 VC。此外，大蒜多糖 93、淫羊藿多糖 94、车前子多糖 95、刺五加多糖 96、黄瓜多糖 97、龙须菜多糖 98、大枣多糖 99、灵芝多糖 100、银耳多糖 101等都具有一定的抗氧化活性。1.2 本课题立题背景、研究意义及主要研究内容1.2.1 立题背景、研
39、究意义(1)虎眼万年青（Ornithogalum Caudatum Ait.）别名鸟乳花，俗名珍珠草，从生态学分类上，它包括鳞茎、块茎和根茎，鳞茎为卵状球形，甚大，有膜质外皮，叶基生，近肉质，带状，长达 60 cm，宽达 5 cm，顶端内卷呈尾状，为多年生草本植物。虎眼万年青作为一种未被开发的药物资源，虽然未见历代本草收载，在药典和地方药材标准中也无其它记载。但在民间广泛应用于治疗癌症、腮腺炎、肝炎等病。国外科学家从虎眼万年青中分离出具有较强抗癌作用的皂苷类化合物 OSW-1102。生理活性筛选实验表明，其体外对肺癌、乳腺癌有明显抗癌活性，对 P338 有细胞毒作用，即对 P338 蛋白质合成
40、前体的结合及核酸的合成有抑制作用，比常见抗癌药喜树碱、阿霉素、紫杉醇抗癌活性还高 10 倍以上，而且对正常细胞没有毒性。吉林省长春中医学院以虎眼万年青生药粉末对肉瘤 S-180、宫颈癌、艾氏腹水癌、实体肝癌瘤株进行抑制实验，研究发现在一定的剂量范围内生药具有显著抑瘤效率，且急性毒性实验未发现明显的毒性反应。近年来长春应用化学研究所新药研究室对虎眼万年青中具有药理活性的多糖成分、皂苷成分及生物碱等成分，初步进行了活性跟踪、结构表征，借助凝胶柱层析和生物质谱的快速、灵敏、特异及化学计量的优点，在分子水平上进行了药物活性的初步筛选，得到了多糖组成的初步信息,并与澳大利亚墨尔本大学植物系进行了免疫学实
41、验和抗肿瘤实验研究。初步研究发现虎眼万年青水溶性多糖成分对小鼠移植性肿瘤 S-180癌细胞株有明显的抑制作用，在免疫学实验中它能明显的提高机体的体液免疫和细胞免疫功能 103，表现为能明显提高荷瘤小鼠淋巴细胞转化指数及白细胞介素 2(IL-2) 的长春师范学院硕士学位论文9生长指数 104，抑制肿瘤的生长和转移，提高荷瘤小鼠 NK 细胞和 LAK 细胞对肿瘤的杀伤率，刺激骨髓细胞增殖 105，证明了多糖是虎眼万年青中重要的生理活性成分。但目前国内外都没有对虎眼万年青大分子多糖的分子质量分布、化学结构和药理活性进行跟踪研究，因而无法确定抑瘤的有效部位或有效部位群，对大分子多糖的抗肿瘤的化学物质基
42、础及作用机理并不十分清楚。因此通过化学、生物化学、药理学、免疫学、临床医学等各学科间的密切合作，对虎眼万年青的有效成分作更进一步的研究，分离纯化其中的化学成分，以药理活性和质谱为“双导向” ，进一步缩小有效成分的范围，阐明它药理作用的物质基础，从中筛选出高效、低毒的既具有抗肿瘤，又能提高机体免疫功能的药物，为吉林省地道药材的开发利用、为寻找更为有效的抗肿瘤天然药物和合成药物提供新的思路和途径，有着极为深远的意义。(2)刺五加属五加科植物，又名五加参、刺拐棒，是一种珍贵药用植物，味辛、微苦、性温、无毒。本草纲目称刺五加为“本经上品 ”，能“补中益气，坚筋骨强意志，久服轻身耐老。民间有“ 宁得一把
43、五加，不用金玉满车” 的说法。刺五加主要分布于东北、华北及陕西、四川、广西等地。根、叶、茎、果实都可供药用。刺五加具有益气健脾、补肾安神、益精壮骨之功效。刺五加中所含的多糖具有很多生物活性，是刺五加中除苷类外的另一类活性成分。程秀娟等 106人的实验证实刺五加多糖对动物实验性移植瘤 S37 和 S180 均有明显的抑制作用，且抑瘤率为 42%和 47%，但对 615 白血病无显著作用。佟丽等 107研究证明刺五加多糖对小鼠肉瘤 S180 细胞和人白血病 K562 细胞的增殖均有强烈的抑制作用，而且对细胞毒作用非常敏感。谢蜀生等 108发现用药的小鼠再次经受同量肿瘤的攻击时而不发生肿瘤，说明小鼠
44、对肿瘤产生了免疫。并且还有报道过刺五加多糖还能增强 CTL 活性和 ConA 刺激小鼠脾细胞产生 L-2109。有研究报道刺五加多糖可作为 LAK 细胞活性增强剂 110。钱农 111的研究表明，刺五加多糖有促诱生干扰素作用，是理想的干扰素诱生剂。实验已证实刺五加多糖有抗感染(特别是抗病毒)增强机体抑抗力，抗肿瘤及免疫调节作用，这与干扰素的生物活性非常相似。刺五加多糖对肿瘤细胞磷酯酰肌醇转换有抑制作用 112。另有报道，磷酯酰肌醇转换增强还与癌基因有关，黄添友等 113研究显示刺五加多糖能显著抑制 S180 细胞膜磷酯酰肌醇转换。袁学千等以环磷酰胺100mg/kg 制造出了免疫抑制小鼠模型，实
45、验结果表明单用刺五加多糖可明显增强小鼠脾脏和肠系膜淋巴细胞数目，脾脏白细胞总体积和淋巴皮质总体积也有所增加，从而证实了刺五加多糖能使免疫器官细胞数目增加，刺五加多糖是理想的免疫增强剂，它可以促进 T 细胞、B 细胞、NK 细胞等细胞因子的产生。上述可知，国内刺五加多糖研究主要在应用方面，但多糖化学、构效关系研究甚少，因此在化学组成和结构研究方面具有许多挑战性的工作需要进行。近年来很多文献报道，用刺五加注射液治疗多种疾病取得了显著的疗效，但对于有效活性成分刺五加多糖的提取分离、化学结构却研究甚少。本文以刺五加叶为研究对象，通过多种提取分离和纯化技术，得到刺五加多糖的不同组分，并采用化学分析和现代
46、仪器分析技术对其以及结构进行更为深入的研究。对其生物活性进行研究探讨，可以为刺五加多糖的进一步研究与开发和构效关系的深入研究提供参考，同时也对其它中药植物多糖长春师范学院硕士学位论文10的研究与开发提供借鉴。1.2.2 研究内容本论文对虎眼万年青和刺五加多糖的提取、分离纯化、纯度鉴定、理化性质、初步结构分析、抗氧化活性及免疫活性等方面进行了较为系统的研究，主要包括一下个方面：虎眼万年青和刺五加多糖的提取工艺研究虎眼万年青和刺五加多糖的分离纯化及理化性质分析虎眼万年青和刺五加多糖的结构初步分析虎眼万年青和刺五加多糖活性研究长春师范学院硕士学位论文11第 2 章 虎眼万年青和刺五加多糖的提取工艺研
47、究多糖的提取是其广泛应用的前提和基础，是研究多糖的最基础工作，其提取过程、工艺、多糖纯度直接影响多糖的生物活性。目前多糖的提取方法有溶剂(热水、稀碱、盐等) 浸提法、酶法、超声辅助提取法、微波辅助提取法和超临界流体萃取法等，为了达到较好的提取效果，往往要根据材料的不同，选用不同的提取方法。本章对虎眼万年青和刺五加多糖的提取方法及其提取条件进行研究，探讨影响水溶性多糖提取得率的因素，并通过正交试验优化提取工艺参数。以期获得高得率、活性好的水溶性多糖，为虎眼万年青和刺五加多糖的开发利用提供理论基础。2.1 实验材料2.1.1 原料虎眼万年青全草，由吉林省白山市白山药检所提供，样品经吉林省药检所鉴定
48、，确认为虎眼万年青；刺五加叶，购于吉林省抚松县二参厂，8 月份采集，经鉴定为刺五加。2.1.2 试剂95%乙醇、乙醚、丙酮、浓硫酸、苯酚、葡萄糖、无水乙醇等试剂均为国产分析纯。2.1.3 仪器UV-2401 型紫外- 可见分光光度计（日本岛津公司） ；电子天平（德国 Sartorius） ；EYEL4 型旋转蒸发器(日本， TOKYO RIKAKIKAI CO)；DZC403 型真空干燥箱（天津天宇机电仪器有限公司） ；ALPHA 24 冷冻干燥机（德国 Marin Christ） ；GSY11型恒温水浴箱（北京市医疗设备厂） ；SHBB88 循环水式多用真空泵（菏泽市生化仪器厂） ；KQ50
49、0E 医用数控超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司)；TDL40B 离心机（上海安亭科学仪器厂） ； LG-2000 高速中药粉碎机（瑞安百信药机器械厂） 。2.2 实验方法2.2.1 多糖含量测定方法用于粗多糖含量测定的方法有很多，一类是利用了多糖的还原性，测定还原性多糖的方法有 3，5-二硝基水杨酸盐(DNS)比色法 114和 Somogyi-Nelson 法。另一类测定方法，也是现在普遍使用的方法，是利用多糖在强酸性条件下脱水生成糠醛或其衍生长春师范学院硕士学位论文12物，然后再与酚类或胺类化合物缩合，生成有特殊颜色的物质的这一性质进行测定，这类方法有地衣酚-硫酸法、苯酚-硫酸法 115和蒽酮-硫酸法 116。苯酚-硫酸法是用得较多的方法，苯酚-硫酸试剂可与游离的寡糖、多糖中的己糖、糖醛酸起显色反应，己糖在 490 nm 处有最大吸收值，吸收值
