1、北京工商大学毕业论文（设计）编号： 1002070109 毕业论文(设计)题目： 院（系） 食品学院 专 业 食品科学与工程 学生姓名 成 绩 指导教师 （职称） 讲师 2013 年 5 月北京工商大学毕业论文（设计）诚信声明本人郑重声明：所呈交的毕业设计(论文)是我个人在导师指导下, 由我本人独立完成。有关观点、方法、数据和文献等的引用已在文中指出,并与参考文献相对应。据我查证，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表和撰写的研究成果，也不包含为获得其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。我承诺，论文中的所有内容均真实、可信。如在文中涉及到抄袭或剽窃行为，本人愿承担由此
2、而造成的一切后果及责任。毕业论文(设计)作者签名： 签名日期： 年 月北京工商大学毕业论文（设计）摘要红曲的药用价值和保健功效日益引人关注，其中洛伐他汀作为红曲主要的调脂因子成为科研热点和红曲产业发展的重点。聚酮化合物 Monacolin K 是其中一种高效的降胆固醇药物，由红曲菌和土曲霉次级代谢产生，本实验研究红曲霉的代谢产物 Monacolin K，通过对红曲霉次级代谢产物的测定，我们确定它产生 Monacolin K 最多的生长期，然后我们对其菌液进行 RNA 提取，通过对RNA 的逆转录，我们得到 cDNA，进行 PCR 扩增，验证 Mokf 和 Mokh 两段目的基因的存在，以及它们
3、对红曲霉代谢产生 Monacolin K 的重要作用。对红曲菌功能基因组的深入研究，以及相应遗传转化体系的建立与完善，我们还需更加努力。关键字：红曲 Monacolin K PCR RNA 提取 红曲霉北京工商大学毕业论文（设计）AbstractThe medicinal value and health care function of red rice is becoming more and more attractive to people, Lovastatin as red rice main lipid factor become research hot spot and fo
4、cus of red rice industry development. Monacolin K, one of potent cholesterol-lowering polyketide compounds, could be produced by Monascus spp and Aspergillus terreus. we experiment on Monacolin K which is one of monascus metabolites. According to the determination of monascus secondary metabolites，W
5、e determined the growing period when it produce Monacolin K fastest. Then we extract RNA on its microbial. Based on the reverse transcription of RNA, we obtain cDNA, then we amplify cDNA using PCR. We validate the existence of two aim genes Mokf and Mokh and their importance to monascus producing Mo
6、nacolin K . With the further study on Monascus functional genomics, as well as the establishment and improvement of the corresponding genetic transformation system, we have to work harder.Key words：Monacolin K red rice PCR extract RNA monascus北京工商大学毕业论文（设计）第一章 绪论 .71.1 红曲和红曲霉 .71.1.1 红曲和红曲霉的概述 .71.1
7、.2 红曲和红曲霉的发展前景 .71.2 红曲霉的生物学特征 .101.2.1 红曲霉的分类 .101.2.2 红曲霉的形态学特征 .101.3 红曲霉的代谢产物 .111.3.1 莫纳克林 K .111.3.2 红曲红素 .131.3.3 桔霉素 .141.4 红曲霉的培养 .141.4.1 固态发酵 .141.4.2 液态发酵 .151.5 洛伐他汀（Monacolin k） .151.5.1 他汀化合物的简述 .151.5.2 他汀类化合物的结构 .161.5.3 红曲洛伐他汀 .161.6 研究内容和意义 .17第二章 实验材料与方法 .182.1 实验材料 .182.1.1 实验所用
8、菌种 .182.1.2 实验所用培养基 .182.1.3 主要仪器和试剂药品 .182.2 实验方法 .202.2.1 菌种培养 .202.2.2 菌落观察及菌落生长情况及代谢产物测定 .212.2.3 DNA 的提取及检测 .21北京工商大学毕业论文（设计）2.2.4 RNA 的提取 .222.2.5 逆转录 RNA 成 cDNA（建立 20ul 反应体系） .242.2.6 PCR 扩增逆转录得到的 cDNA.25第三章 实验结果与分析 .263.1 实验结果 .263.1.1 菌落形态观察 .263.1.2 菌种生长曲线 .273.1.3 莫纳克林 K 代谢情况 .273.1.4 红曲霉
9、 DNA Pcr 扩增琼脂糖凝胶荧光观察（mokf 和 mokh） .283.1.5 红曲霉种子液 RNA 提取 结果 .293.2 实验结果分析 .293.3 注意事项 .303.3.1 培养菌中的相关事项 .303.3.2 提取 RNA 和 DNA 中的相关 事项： .30第四章 结论与展望 .314.1 结论 .314.2 展望 .32致谢 .34参考文 献 .35附录 .36文献翻译.39文献 原文.52第一章 绪论1.1 红曲和红曲霉1.1.1 红曲和红曲霉的概述红曲是以籼米为原料采用现代生物工程技术分离出的优质红曲霉菌(Monascus purpureus)经液体深层发酵而成，是一
10、种纯天然、安全性高、有益于北京工商大学毕业论文（设计）人体健康的食品添加剂。红曲生产历史悠久，是我国传统的发酵食品，也是现代社会应用广泛、药食同源的保健品。目前关于红曲定义的范围有所延伸，广义的红曲是指以红曲霉为菌种发酵(包括固态和液态发酵)淀粉质原料而制得的各种产品的总称。红曲霉以能产生大量红曲色素而得名，红曲霉(Monascus)中文别名 红曲、红糟、红大米，属于散囊菌目中的子囊菌曲霉科真菌，主要存在于树木、土壤中。红曲可用于酿酒、制醋、豆腐乳的着色剂和调味剂，也可做中药 1。红曲自古以来在我国一直用于食品的着色，特别是肉制品的着色。由于化学合成色素的毒副作用，研究者正致力于天然色素特别是
11、生物色素的研究与开发 2，其中红曲霉生产的红曲色素得到了较为深入的研究用天然红曲色素代替合成色素用于食品、化妆品、药品的着色，已成为发展趋势。近年来，红曲在我国的应用有增无减。随着研究的不断深入，工艺的不断更新，市场上的红曲系列产品种类越来越多 3。红曲的产地多集中于我国福建、广东、浙江、台湾等地，福建省古田的红曲最为著名。如今，我国红曲产品的年生产能力不断提高，可达2 万多吨，产值也达数亿元。目前应用范围较广泛的红曲产品是用于食品着色的红曲红，用于酿酒的红曲米及用于医疗保健的功能红曲等。国内代表产品主要有：红曲红色素、红曲米、 “血脂康” 、 “脂必妥”等。1.1.2 红曲和红曲霉的发展前景
12、降低血脂及抑制胆固醇合成 血脂即为血浆中所含的脂类物质，其中包括胆固醇，胆固醇酯，甘油三酯及磷脂等。这些东西可以来自饮食，也可以由机体合成。体内合成的血脂约占血脂总量的 70 %。 4早在明代李时珍本草纲目 对红曲作了较全面的记载，认为其“破血、活血 ”功效显著。经过现代人们的研究发现红曲霉的发酵产物之一莫纳克林 K 是天然他汀类物质，能有效降低血脂及抑制胆固醇的合成，具有综合调节血脂，实现“ 三降一升 ”，即降低胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白，升高高密度脂蛋白。清除血管垃圾，从而达到保护血管内皮，一级预防和二级预防各类心脑血管疾病，如脑中风、冠心病、高血压、心肌梗死等 5。有数据显示，莫纳克
13、林 K 在血液中的浓度只要达到 0.001-0.005 g/mL，就可以使胆固醇的合成受阻。因此被广泛应用于药品、保健品中。目前，含有莫纳克林类物北京工商大学毕业论文（设计）质的红曲己被开发成降血脂和治疗心血管等疾病的新药 6。有关这方面的研究是当今红曲研究的热点之一，很多研究机构投入了很大的人力物力，希望能取得长足的进步。降血糖作用红曲霉的培养物作饲料进行动物试验，发现试验兔在进食饲料后 0.5 h 内血糖降低了 23%-33%，而在 1h 后血糖量仍比对照组下降了 19%-29%7。降血压作用研究发现红曲还可作血压升高剂,对血压有双重控制作用。在饲料中添加红曲霉培养物的动物试验中,发现添加
14、 0.2%-0.3%的红曲霉培养物的饲料， 可使患先天性高血 压老鼠的血压由超过 266KPa(200mmHg)降至 24.0 KPa (180mmHg) 以下，其有效成分为 c氨基丁酸(GABA) 和葡萄糖胺或红曲霉的其它细胞壁成分 。分别添加含有该生理活性物质的红曲米 0.25%和 0.35%， 用以制成 180烤制的面包 140高压瞬间加热的酱与不添加上述降压物质的普通面包和酱作对比试验，其降压效果明显 8。红曲对自发高血压大鼠、 DO-CA-盐型高血压大 鼠有明显的降血压作用 。每日经口服给予 SHR 大鼠、肾血管型高血压大鼠 (RHR) 及 DHR 大 鼠 0.0、0.4、 0.8
15、和 1.2g/kgBW 红 曲 3 4 周 ， 每周测量收缩(SBP) 1 次.结果显示,红曲能够降低 SHR 、DO-CA-盐型高血压大鼠 (P0.05),对R H R 大鼠的降血压作用不明显,其中 DO-CA-盐型高血压大鼠的降血压作用强于 SHR。食品着色剂食用色素因其可以改善食品外观和色泽的功能，成为食品添加剂重要的组成部分。食用色素目前主要分为两大类：天然色素和合成色素 9。随着人们对健康的关注，天然色素以其安全、绿色、无毒而备受青睐。天然色素主要是指从动植物材料和微生物细胞中获取的具有着色功能的产品。但是动植物材料生长繁殖受季节、气候、产地等多种因素影响，存在原料不足，产品价格昂贵
16、等缺点，使应用受到限制，而利用微生物资源生产天然色素，可以有效避免这些缺点，而且工业化生产更为方便，因此，采用微生物生产天然色素将逐渐成为主流。红曲红素是一种由红曲霉属的丝状真菌经发酵而成的优质天然食用色素，是红曲霉的次级代谢产物，不仅广泛应用于食品工业，还广泛应用于医药和化北京工商大学毕业论文（设计）妆品行业。红曲发酵产生的红曲红色素色泽鲜艳、色调纯正、饱满、光热稳定性好，是天然绿色理想的食品着色剂，常应用于肉制品、果汁、色酒、果酱、饮料、糖果、糕点等食品的加工中 10。工业化产品红曲精纯片 红曲精纯片除了不含任何添加剂，没有胶囊外壳，所以可长期服用对肠胃无任何刺激作用的优点以外还具有五大优
17、势。一、红曲霉菌以大米为培养基，经过发酵后合成天然他汀，同时也产生对人体有害的桔霉素 11。这是一个很难攻克的世界性难题，研制组经过无数次试验、摸索和工艺改进。终于把桔霉素的问题解决了，通过国家权威检测机构(无锡理工大学生物工程学院)检测出“桔霉素为零”的红曲产品。二、红曲精纯片里面的他汀含量居世界首位，这是难以想象的成就，让我们的分离提纯减轻了很大的负担。三、从他汀分子结构方面来讲，红曲精纯片中所含天然他汀的开环率最高，所以无须增加肝脏负担，对肝肾无损伤，活性强，效果显著，国内国际领先。四、经过 10 余年的努力，经过 30 代红曲菌优化选育，培育出活性更高，更稳定、效果更佳的红曲精纯片。它
18、富含八种高纯度高活性的天然他汀小分子，对血脂有全面的调节作用，克服了化学合成他汀严禁组合使用的致命弱点。五、用大豆和大米共同作为培养基来代谢天然他汀的技术，这个技术是世界上绝无仅有，所以红曲精纯片中除含丰富的他汀以外，还有皂甙、黄酮、甾醇、18 种氨基酸、脂肪酸、微量元素硒、铁、钙、锌等，维生素 E、B1、B2 等等 12。综上所述：红曲具有广阔的应用前景及研究价值，它走在时代的前沿。1.2 红曲霉的生物学特征1.2.1 红曲霉的分类红曲中的红曲霉属于真菌门，子囊菌亚门，真子囊菌纲，散子囊菌目，红曲菌科，红曲菌属的真菌。中国科学院微生物研究所和轻工部食品发酵研究所(1983)正式收集编目的重要
19、红曲霉有8种48个菌株。这8种为：紫红曲霉、安卡红曲霉、红色红曲霉、巴克红曲霉、烟色红曲霉、发白红曲霉、锈色红曲霉、变红红曲霉、布谷昭(1988)从酒曲、腐乳、酒糟及土壤和腐败果实中共分离到约20种红曲霉 13。日本学者佐藤喜吉(Kikichi Sato) 利用各种培养基上红曲菌的生长情况和菌落特征进北京工商大学毕业论文（设计）行分类，先后命名了13个种；日本学者冢广(Hiroshi)和我国台湾学者林庆福先生利用PDA，曲汁加乙醇和普氏液加氯化钠等培养基观察红曲菌的生理特征，将红曲菌分为四个群14个种。Hawskworth和Pitt(1983)采用MEACYA和G25N三种培养基在25条件下培
20、养红曲菌，观察了一些模式菌株和许多新分离的菌株，将文献中记载的种名归入他们仅承认的三个种，并拟定了2个分类检索表。随后，多位学者在分类鉴定和描述新种时使用了上述三种培养基在25条件下培养红曲菌 14。1.2.2 红曲霉的形态学特征营养结构 菌丝体初期在粳米粒内部生长，无色，渐变为红色，并使米粒变成紫红色。菌丝体大量分枝具有横隔，多核，分枝繁密且不规律，内含橙、紫红色颗粒，在分枝的顶端产生单个或成串的分生孢子。孢子呈球形或椭圆形。闭囊壳橙红色，近球形，含有多数子囊，子囊内含 8 个孢子，子囊孢子卵形或近球形，光滑，透明，无色或漆红色。菌丝细胞幼时含有颗粒，老后含有空泡及油滴。菌丝体中常出现联结现
21、象，两条菌丝生长在一处时由一个细胞产生突起，另一细胞的细胞壁消失，使二者沟通交流。无性繁殖 红曲霉无性生殖时，由菌丝生出分生孢子梗，并在顶部长出分生孢子，分生孢子以单生或以向基式生出 26 个成链。分生孢子大多为梨形，部分为球形，多核，萌发后形成菌丝继续生长繁殖。有性生殖 红曲霉有性生殖时在菌丝顶端或侧枝顶端首先形成一个单细胞多核的雄器，随后在雄器下面的细胞处以单轴方式又生出一个细胞，这个细胞就是原始的雌器。由于雌性器官的生长和发育，将雄器向下推，使雄器与柄把呈一定角度。这时雌性器官又在顶部生成一层隔膜，分成两细胞，顶端的细胞为受精丝，另一细胞即为产囊器。当受精丝尖端与雄器接触后，接触点的细胞壁解体产生一孔。雄器内的核和细胞质通过受精丝进入产囊器进行质配。在两性器官下面的细胞生出许多菌丝将其包围，形成初期被子器。被子器内产囊器膨大并生成许多产囊丝。每个产囊丝产生许多多核细胞，此时发生核配，经过核配的细胞为子囊母细胞。每个子囊细胞中的核发生三次分裂，形成 8 个子囊孢子。此时被子器已经发育成熟子囊消解，子囊孢子成堆留在被子器内，就像其中只有一个子囊。被子器外壳破裂后，子囊孢子散出，子囊孢子萌发后又形成
